“Metoda uređivanja genoma ne bi se trebala suprotstavljati tradicionalnim metodama selekcije. “Ovo je prilično novi alat”, naglašava voditeljica laboratorija otpornosti biljaka na stres Sveruski istraživački institut za poljoprivrednu biotehnologiju (VNIISB) Vasilij Taranov. – Nekada su kirurzi radili operacije nožem, onda su se pojavili skalpeli, zatim laseri. Kirurgiji su postale dostupne sasvim druge mogućnosti. Dakle, genetski inženjering nudi alat s kojim možete nešto uzeti i poboljšati, ali ne poništava niti zamjenjuje sve što je prije korišteno.”
Sveruski istraživački institut za poljoprivrednu biotehnologiju (VNIISB) upravlja laboratorijem za otpornost biljaka na stres, čiji se rad odvija u dva glavna smjera: potraga za genima koji određuju otpornost biljaka na abiotski i biotički stres i uređivanje genoma kultiviranih biljaka kako bi se povećala njihova otpornost na stres. Područje istraživanja znanstvenika uključuje krumpir i povrće otvorenog tla.
S voditeljem laboratorija Vasilijem Taranovim i višom znanstvenom suradnicom Marinom Lebedevom razgovaramo o tome koje su značajke i prednosti najnovijih tehnologija, kakve rezultate mogu postići i za koje probleme ruskih poljoprivrednih proizvođača s njima rješavaju laboratorijski znanstvenici.
– Danas se puno govori o potrebi ubrzanja procesa selekcije. Vjeruje se da metoda uređivanja genoma to omogućuje. To je istina?
V.T.: Ispravnije bi bilo reći da biotehnološke metode pomažu ne toliko ubrzati selekciju koliko proširiti sposobnosti znanstvenika. Proces rada na sorti i dalje ostaje prilično dugotrajan, budući da je riječ o biljkama koje imaju određeni životni ciklus.
Ali stručnjacima postaje moguće postići rezultate koje bi bilo iznimno teško (ako ne i nemoguće) postići tradicionalnim metodama uzgoja.
Uz pomoć genomskog editiranja možemo ciljano unijeti mutaciju koja izravno utječe na pojedino svojstvo sorte, a da ostatak kompleksa gospodarski vrijednih svojstava ostane nepromijenjen.
M.L.: Zamislite da želimo uvesti gen otpornosti iz divljeg krumpira u našu kultiviranu sortu koristeći tradicionalne metode uzgoja. Da bi to učinio, uzgajivač provodi niz križanja "divljaka" s određenim kulturnim linijama. Problem je što se uz gen otpornosti u sortu prenose i svi ostali “divlji” geni, što je najčešće krajnje nepoželjno. Genetski inženjering omogućuje uzimanje/promjenu samo jednog željenog gena.
– Postoji stajalište da, unatoč činjenici da je metoda uređivanja genoma poznata već desetak godina, još uvijek nije dala zapažene komercijalne rezultate.
V.T.: Ovo nije posve točno. Vodeće svjetske uzgojne tvrtke koriste se editiranjem genoma i to ne skrivaju. Ali ne znamo što točno rade i kakve rezultate postižu.
Postignuća se ne reklamiraju jer je skuplje staviti na tržište biljku prerađenu metodama genetskog inženjeringa nego onu dobivenu na tradicionalan način. A ponekad je to jednostavno nemoguće učiniti.
U isto vrijeme, vrlo je teško dokazati da je uređivanje genoma korišteno za stvaranje određene sorte koristeći postojeće metode.
Tijekom testa stručnjaci će tražiti slijed markera u genomu organizma; ako je prisutan, biljka će biti prepoznata kao genetski modificirana. Ali kod genomskog uređivanja ništa se ne unosi u genom, pa se ništa ne može pronaći.
Promjene često ne zahvaćaju samo jedan gen, već određeno mjesto u genu, doslovno jedan nukleotid, jedno slovo. A preostale milijarde slova ostaju onakva kakva su bila. Da biste utvrdili da je biljka uređivana, trebate zapravo pročitati njezin cijeli genom, s pokrivenošću deset puta većom od standardne kako biste eliminirali pogrešku. Nitko neće raditi tako obimnu i vrlo skupu analizu, a oplemenjivač uvijek može reći da je biljku dobio mutagenezom ili tradicionalnom selekcijom.
– M.L.: Uređivanje genoma općenito, a posebno iskustvo korištenja ovih tehnologija na biljkama, relativno je nova priča.
Ne samo zato što da biste promijenili značajku morate znati što točno i kako urediti. Svojstva biljaka određuju geni, najčešće skup gena, iz kojih je potrebno odabrati pogodne mete za uređivanje. No razjašnjavanje funkcija i regulacije specifičnih gena koji pridonose značajkama od interesa zahtijeva složena i često dugotrajna istraživanja. U usporedbi sa životinjama i ljudima, možemo reći da ne poznajemo dobro mnoge molekularne mehanizme svojstava biljaka (primjerice, otpornost, produktivnost itd.). Pritom su genomi biljaka veći i složeniji, što nimalo ne pojednostavljuje zadatak. No, temeljnim istraživanjima u biljnoj biologiji mnogo se već zna i što više to razumijemo, to su nam veće mogućnosti modifikacije.
Osim toga, riječ je o metodi koja omogućuje korekciju određenih svojstava, ali ne i uvođenje novih sorti na tržište, na čemu se, unatoč određenom ubrzanju, još uvijek radi godinama.
– Rade li biotehnolozi editiranje gena? Kako određuju stvarni smjer rada (svrhu uređivanja)?
V.T.: Biotehnolog mora raditi u tandemu s uspješnim uzgajivačem odabranog usjeva i, idealno, uključiti druge specijalizirane proizvođače. Uzgajivač, zajedno s poljoprivrednicima, postavlja zadatak, uzgajivač pomaže odabrati odgovarajuće genotipove. Mi se pak savjetujemo s biokemičarima i genetičarima, razmišljamo što možemo ponuditi na temelju toga (potrebne karakteristike nisu uvijek dovoljno proučene s biološke točke gledišta). Gledamo što zapravo možemo napraviti, obaviti svoju fazu rada, vratiti dobivenu liniju uzgajivaču, a uzgajivač donosi rezultat sorti.
- Je li uređivanje genoma skupa tehnologija?
V.T.: Trošak dobivanja biljke ovisi o usjevu i je li dobivena biljka uređena ili transgena.
Ako govorimo o opremi, tada će za tvrtku koja se već bavi dobivanjem materijala bez virusa i mikrokloniranjem kupnja opreme i reagensa za uređivanje genoma koštati relativno mali iznos. Prepreka za početak takvog posla možda i nisu prevelika ulaganja, već nedostatak kvalificiranog kadra. Vrlo je malo ljudi koji mogu preuzeti i obaviti tako specijalizirani zadatak.
I da se vratimo na troškove: tehnološki napredak na ovom području je vrlo brz. Metode uređivanja genoma, recimo 2012. godine, kada je otkriven CRISPR/Cas9 (tehnologija uređivanja genoma viših organizama, temeljena na imunološkom sustavu bakterija), i ovoga što imamo sada jako se razlikuju. Učinkovitost poslovanja se iz godine u godinu povećava, a troškovi smanjuju.
M.L.: To se može usporediti s projektom sekvenciranja ljudskog genoma. Prvi ljudski genom sekvencirao je međunarodni konzorcij 10 godina za 2.7 milijardi dolara jednostavno zato što su takve tehnologije bile dostupne 90-ih. Trenutačno sekvenciranje kompletnog ljudskog genoma košta manje od 1000 dolara i traje nekoliko dana.
– Prijeđimo na razgovor o vašem laboratoriju, je li usmjeren na temeljnu znanost ili primijenjena istraživanja?
V.T.: Trudimo se oboje. U početku je prioritet dat temeljnim stvarima, ali sada pokušavamo primijeniti naš razvoj u praksi.
Trenutačno, na primjer, proučavamo mehanizme otpornosti krumpira na virus Y. To je puno fundamentalnog rada, ali ako uspije, rezultat će biti vrlo zanimljiv za selekciju otpornih sorti.
M.L.: Fundamentalna i primijenjena znanost usko su povezane, jedna bez druge ne može postojati. Ako ne znamo kako virus stupa u interakciju s biljkom, s kojim specifičnim proteinima, nećemo ih moći promijeniti kako bi biljka postala otporna.
Istraživanja virusa Y provodimo od 2018. i sada se približavamo činjenici da ćemo u sljedećih nekoliko godina dobiti formulu otpornosti, au budućnosti i neophodan praktični rezultat: biljka krumpira neće sintetizirati virusne proteine, već bit će otporan na virus.
– Surađujete li s ruskim uzgojnim tvrtkama/uzgajivačima?
V.T.: Na krumpiru radimo s mladom uzgajivačicom Mariom Polyakovom, aktivno komuniciramo sa stručnjacima iz Unije krumpira i održavamo kontakte s Saveznim centrom za istraživanje krumpira nazvanim po. A.G. Lorja. Što se tiče kupusa, surađujemo s uzgajivačima i uzgajivačima sjemena Ruskog državnog agrarnog sveučilišta - Moskovske poljoprivredne akademije nazvane po. K.A. Timirjazeva Grigorija i Sokrata Monahosa. I u onome što radimo na ovom području u potpunosti se vodimo njima.
– I opet o virusima. Marina Valerievna, vaš raspon znanstvenih interesa ne uključuje samo virus Y. Godine 2023. dobili ste potporu Ruske znanstvene zaklade za provođenje istraživanja na projektu „Studija viroma kultiviranog krumpira (Solanum tuberosum L.) korištenjem visokoučinkovitih metoda sekvenciranja“. Zašto je ova tema zanimljiva?
M.L.: Krumpir u većoj mjeri od mnogih drugih biljaka pati od virusnih bolesti, budući da se razmnožava vegetativno. Virusi se nakupljaju u gomoljima i prenose na sljedeće generacije, tako da virusno opterećenje stalno raste. Kad kažu da krumpir degenerira, upravo o tome govorimo.
Virusi nisu inertni sustavi; oni aktivno komuniciraju i s biljkom domaćinom i međusobno. Postoje slučajevi u kojima se biljka koja je već zaražena jednim specifičnim virusom ne može zaraziti drugim. A postoje virusi koji ne mogu sami zaraziti biljku, oni djeluju samo u suradnji s drugim virusima. Nedavno je objavljen rad koji opisuje oblike virusa koji pomažu biljkama da prežive sušu. Takav neočekivani prijelaz iz parazitizma u mutualizam.
Ne postoje učinkovita kemijska sredstva za suzbijanje virusnih bolesti na krumpiru. Da bi se poboljšalo njegovo zdravlje, razvijene su prilično složene i, što je najvažnije, skupe metode: kroz in vitro kulturu, dobivanje mikrogomolja. Ali rezultat traje samo nekoliko generacija. Da biste pronašli druga rješenja, morate detaljnije proučiti karakteristike virusa, tako da je studija vrlo, vrlo relevantna.
– GOST 33996-2016 „Sjemenski krumpir. Tehnički uvjeti i metode za utvrđivanje kakvoće" navedeno je pet virusa (PVK - X virus krumpira; SBK - S virus krumpira; MVK - M virus krumpira; YBK - Y virus krumpira; VSLK - virus kovrčavosti lista. krumpir) i jedan viroid (PSTV – potato spindle tuber viroid). Hoćete li se usredotočiti na njih?
M.L.: Moj projekt ima za cilj korištenje visokoučinkovitih metoda za proučavanje onih viroma (zbirki virusa) koji su prisutni na krumpiru u Rusiji. Ovo je zanimljivo kako s gledišta kakvi se kompleksi različitih virusa nalaze na jednoj biljci, tako i s gledišta rasprostranjenosti tih virusa.
Ukupno je u svijetu poznato više od 50 virusa koji se nalaze na krumpiru. Oni navedeni u GOST-u su među najopasnijim, a osim toga, imaju jasne vanjske znakove. Stoga je mozaična nekroza uobičajena manifestacija infekcije virusom Y, a prisutnost virusa uvijanja lišća može se odrediti karakterističnom deformacijom lisnih ploški.
Ali postoje mnogi virusi koji se ne manifestiraju fenotipski, iako također mogu utjecati na usjev. Rijetko ih se otkrije, ali samo zato što se ne traže.
Kao primjer mogu navesti rad kolega iz Sveruskog istraživačkog instituta za zaštitu bilja (VIZR). Godine 2019. objavili su članak o otkriću virusa krumpira P u Rusiji. Ranije se vjerovalo da je distribuiran isključivo u Južnoj Americi.
Pitanje je što ćemo otkriti ako ne gledamo “ispod ulične rasvjete” gdje je svjetlo, nego tamo gdje još nismo gledali.
– Gdje ćete provoditi svoje istraživanje?
M.L.: Prema uvjetima bespovratnih sredstava, projekt će trajati dvije godine. Prošle godine smo surađivali s farmom krumpira u regiji Tula, prikupljali materijal, radili s različitim sortama i reprodukcijama. Ove godine ćemo otići u druge regije i vidjeti kakvih virusa ima tamo.
Rezultati studije bit će sažeti 2025. godine, a mi ćemo ruskim uzgajivačima krumpira svakako reći o njima.