S N. Elanski, L.Yu. Kokaeva, N.V. Statsyuk, Yu.T. Djakov
Uvod
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary - uzročnik kasne bolesti, najvažnije gospodarske bolesti krumpira i rajčice - privlači pomnu pozornost istraživača iz različitih zemalja već više od stoljeća i pol. Iznenada se pojavio u Europi sredinom XNUMX. stoljeća, izazvao je epidemiju krumpira koja je ostala u sjećanju mnogih generacija.
Do sada se često naziva "gljivom irske gladi". Gotovo stotinu godina nakon prvih epidemija otkrivene su divlje meksičke vrste krumpira otporne na kasnu plamenjaču, razvijene su metode križanja s uzgajanim krumpirom (Muller, 1935.) i dobivene su prve sorte otporne na kasnu plamenjaču (Pushkarev, 1937.). Međutim, ubrzo nakon početka njihovog komercijalnog uzgoja, nakupljale su se rase patogena kasne bolesti koji su bili virulentni prema rezistentnim sortama. i uvođenje novih gena otpornosti divljeg meksičkog krumpira u sorte počelo je brzo gubiti učinkovitost.
Neuspjesi u primjeni monogenog (vertikalnog) otpora natjerali su uzgajivače da traže složenije načine iskorištavanja nespecifične poligenske (vodoravne) rezistencije. Posljednjih godina u pojedinim populacijama parazita počele su se nakupljati vrlo agresivne rase, uzrokujući eroziju čak i nespecifične rezistencije. Pojava sojeva otpornih na fungicide uzrokovala je probleme u korištenju kemikalija za zaštitu krumpira.
Zbog značajnih razlika između oomiceta i gljivica u kemijskom sastavu, ultrastrukturi i metabolizmu, fungicidi, posebno sustavni, koji se koriste za zaštitu biljaka od mnogih gljivičnih bolesti, neučinkoviti su protiv oomiceta.
Stoga je u kemijskoj zaštiti od kasne bolesti korišteno višestruko (do 12 puta u sezoni ili više) prskanje kontaktnim pripravcima širokog spektra djelovanja. Revolucionarni korak bila je upotreba fenilamida koji su toksični za oomicete i sustavno se šire u biljkama. Međutim, njihova široka upotreba brzo je dovela do nakupljanja rezistentnih sojeva u populacijama gljiva (Davidse i sur., 1981.), što je značajno zakompliciralo zaštitu bilja. P. infestans je praktički jedini parazit umjerenog pojasa, čija se šteta u organskom uzgoju ne može neutralizirati bez upotrebe kemijskih sredstava zaštite (Van Bruggen, 1995).
Navedeno objašnjava ogromnu pozornost koju su istraživači iz različitih zemalja posvetili proučavanju populacija P. infestans, dinamici njihove brojnosti i genetskom sastavu, kao i genetskim mehanizmima varijabilnosti.
Životni ciklus R. INFESTANS
Oomycete Phytophthora infestans razvija međustanični micelij s haustorijom unutar lišća krumpira. Hraneći se tkivima lišća, uzrokuje stvaranje tamnih mrlja koje po vlažnom vremenu postaju crne i trule. Snažnim porazom cijeli list umire. Nakon razdoblja hranjenja, na miceliju nastaju izdanci - sporangiofori - koji rastu prema van kroz stomate. Za vlažnog vremena stvaraju bijeli cvat oko mjesta na donjoj strani lišća. Na krajevima sporangiofora nastaju zoosporangije u obliku limuna koje se prekidaju i prenose prskanjem kiše (slika 1). Padajući u kapljice vode na površinu lista krumpira, sporangije klijaju s 6-8 zoospora, koje su nakon razdoblja kretanja zaobljene, prekrivene ljuskom i klijaju cijevi klice. Klica prodire kroz stomate u tkivo lista. Pod određenim uvjetima, sporangije mogu rasti u cijevi za rast izravno u tkivo lišća. Pod povoljnim uvjetima, vrijeme od infekcije do stvaranja nove sporulacije je samo 3-4 dana.
Jednom na tlu i filtrirane kroz tlo, sporangije su sposobne zaraziti gomolje. Jako zahvaćeni gomolji trunu tijekom skladištenja; kod slabo zahvaćenih infekcija može potrajati do sljedeće sezone. Uz to, uzročnik kasne bolesti može se zadržati zimi u obliku oospora (spolnih spora s debelim zidovima) u tlu na biljnim ostacima i na sjemenkama rajčice. Oospore nastaju na živim biljnim organima kada se sojevi različitih vrsta parenja susretnu s prekomjernom vlagom. U proljeće se na zasađenim zaraženim gomoljima i na biljnim ostacima s oosporama stvara nespolna sporulacija; zoospore ulaze u tlo i uzrokuju infekciju donjeg lišća biljaka. U nekim slučajevima micelij može rasti iz zaražene gomolje duž zelenog dijela biljke i obično se pojavljuje u gornjem dijelu stabljike.
Značajna razlika između oomiceta i većine gljivica leži u prevladavanju diplofaze u njihovom životnom ciklusu s gametskom mejozom i klijanjem zigota (oospora) bez reduktivne nuklearne fisije. Čini se da ova značajka, plus dipolarni heterotalizam, koji zamjenjuje biseksualnost, omogućuje primjenu na oomicete pristupa razvijenih za proučavanje populacija viših eukariota (analiza panmiksije i podjele populacija, intra- i interpopulacijski protok gena, itd.). Međutim, tri čimbenika ne dopuštaju potpuno prenošenje ovih pristupa u proučavanju populacija P. infestans.
1. Zajedno s hibridnim oosporama, u populacijama se stvaraju samoplodne i partenogenetske oospore (Fife i Shaw, 1992 .; Anikina i sur., 1997.; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002 .; Smirnov, 2003.), a učestalost njihovog nastanka može biti dovoljna da utječe na rezultatima ispitivanja.
2. Spolni proces u P. infestans daje beznačajan doprinos dinamici veličine populacije, jer se gljiva reproducira uglavnom vegetativnim sporama, čineći za više od 90% rezultata analize vrste parenja tradicionalnom metodom na hranjivom mediju ... sezona rasta je nekoliko generacija aseksualne sporulacije (razvoj policikličke bolesti). Oospore imaju važnu ulogu u očuvanju organizma u razdoblju kada nema zelenih biljaka (zimi) i u primarnoj zarazi sadnica. Zatim, tijekom ljeta dolazi do klonske reprodukcije i povećanja ili, obratno, smanjenja broja pojedinačnih klonova koji nastaju kao posljedica spolne rekombinacije, što se uglavnom određuje odabirom prilagodljivijih. Prema tome, omjer pojedinih klonova u populaciji na početku i na kraju epifitotika može biti potpuno različit.
3. Opisani ciklus karakterističan je za domaće populacije P. infestans u njihovoj domovini, Srednjoj Americi. U drugim dijelovima svijeta, više od 100 godina, spolni proces nije bio poznat; vegetativni micelij u zaraženim gomoljima krumpira bio je faza zimovanja. Životni ciklus bio je potpuno agamičan, a širenje je imalo žarišnu prirodu: infekcija iz pojedinačno zaraženih posađenih gomolja prelazila je u lišće, stvarajući primarna žarišta bolesti, koja bi se mogla stopiti s masovnim razvojem bolesti.
Dakle, u nekim regijama može doći do izmjene spolnih i aseksualnih ciklusa, dok u drugima - samo aseksualnih.
Porijeklo P. INFESTANS
P. infestans pojavili su se u Europi krajem prve polovice 1991. stoljeća. Budući da je krumpir porijeklom iz sjeveroistočnog dijela Južne Amerike, pretpostavljalo se da je parazit odatle dopremljen u Europu tijekom procvata čileanske šalitre. Međutim, studije provedene na krumpirovoj stanici Rockefeller Center u dolini Toluca u Meksiku prisilile su na reviziju ovog stava (Niederhauser 1993, XNUMX).
1. U dolini Toluce lokalne gomoljaste vrste krumpira (Solanum demissum, S. bulbocastanum, itd.) Imaju različite setove gena za vertikalnu rezistenciju u kombinaciji s visokom razinom nespecifične rezistencije, što ukazuje na dugu zajedničku evoluciju s parazitom. Južnoameričkim vrstama, uključujući usjev krumpir, nedostaju geni otpornosti.
2. U dolini Toluce postoje izolati s tipovima parenja A1 i A2, što je rezultiralo rasprostranjenošću križane populacije P. infestans; dok se u domovini uzgajanog krumpira, Južnoj Americi, parazit širi klonski.
3. U dolini Toluce godišnje se javljaju ozbiljne epidemije kasne bolesti. Stoga se među sjevernoameričkim istraživačima (Sveučilište Cornell) utvrđuje mišljenje o Mesoamerici (Srednja Amerika) kao rodnom mjestu fitoftore krumpira (Goodwin i sur., 1994.).
Južnoamerički istraživači ne dijele ovo mišljenje. Vjeruju da uzgajani krumpir i njegov parazit P. infestans imaju zajedničku domovinu - južnoameričke Ande. Podržali su svoje stajalište molekularnim studijama o analizi DNA polimorfizama mitohondrijskog genoma (mtDNA) i nuklearnih gena RAS i β-tubulina (Gomez-Alpizar i sur., 2007.). Pokazali su da sojevi prikupljeni iz različitih dijelova svijeta potječu od tri divergentne linije predaka, koje se (sve tri) nalaze u južnoameričkim Andama. Andski haplotipovi potomci su dviju linija: izolati najstarije loze mtDNA nalaze se na samoniklim solanaceae-ima iz odsjeka Anarrhicomenum u Ekvadoru, dok su izolati druge linije uobičajeni na krumpiru, rajčicama i divljim noćuracima. U Toluci čak i rijetki haplotipovi potječu iz samo jedne loze, s genetskom varijabilnošću sojeva Toluca (mala alelna učestalost nekih varijabilnih mjesta) sugerira snažni učinak osnivača zbog nedavnog zanošenja.
Uz to, u Andama je pronađena nova vrsta P. andina, morfološki i genetski slična P. infestans, koja prema autorima ukazuje na Ande kao žarište specijacije u rodu Phytophthora. Napokon, u Europi i Sjedinjenim Državama, populacije P. Infestans uključuju obje andske loze, dok u Toluci samo jednu.
Ova je publikacija potaknula odgovor skupine istraživača iz različitih zemalja, koji su napravili puno eksperimentalnih radova na reviziji prethodno izvedene studije (Goss i sur., 2014.). U ovom su radu prvo korištene informativnije mikrosatelitske sekvence DNA za proučavanje polimorfizama DNA; drugo, za analizu klastera, migracijskih putova, vremena divergencije populacija itd. korišteni su napredniji modeli (F-statistika, Bayesove aproksimacije itd.) i, treće, upoređena je ne samo s andskom vrstom P. andina, u kojoj je uspostavljena hibridna priroda (P. infestans x Phytophthora sp.) , ali i s meksičkim endemskim vrstama P. mirabilis, P. Ipomoeae i Phytophthora phaseoli - genetski bliskim P. infestans koji pripadaju istoj kladi (Kroon i sur., 2012.). Kao rezultat ovih analiza nedvosmisleno je pokazano da korijenski dio filogenetskog stabla svih vrsta roda Phytophthora uzetih u istraživanje, osim hibrida P. andina, pripada meksičkim sojevima, a migracijski tok ima smjer Meksiko - Ande, a ne obrnuto, a njegov se početak podudara s europskim kolonizacija Novog svijeta (prije 300-600 godina). Dakle, pojava vrste P. infestans specijalizirane za poraz krumpira dogodila se u sekundarnom genetskom središtu stvaranja gomoljastih solanaceae, t.j. u Srednjoj Americi.
Genom P. INFESTANS
2009. godine međunarodni je tim znanstvenika sekvencirao kompletni genom P infestansa (Haas i sur., 2009.), čija je veličina bila 240 MB. To je nekoliko puta više nego kod usko povezanih vrsta P. sojae (95 Mb), uzrokujući truljenje korijena soje i P. Ramorum (65 Mb), utječući na takve vrijedne vrste drveća kao što su hrast, bukva i neke druge. Dobiveni podaci pokazali su da genom sadrži velik broj kopija ponovljenih sekvenci - 74%. Genom sadrži 17797 gena koji kodiraju proteine, od kojih su većina geni uključeni u stanične procese, uključujući replikaciju DNA, transkripciju i translaciju proteina.
Usporedbom genoma roda Phytophthora otkrivena je neobična organizacija genoma, koja se sastoji od blokova sekvenci konzerviranih gena, u kojima je gustina gena relativno visoka, a sadržaj ponovljenih sekvenci relativno nizak, te pojedinih regija s nesačuvanim genskim sekvencama, s niskom gustinom gena i velikim sadržajem regija koje se ponavljaju. Konzervativni blokovi čine 70% (12440) svih gena koji kodiraju proteine P. infestans. Unutar konzervativnih blokova geni su obično usko udaljeni, s prosječnom međugenom udaljenostom od 604 bp. U područjima između konzervativnih blokova međugena udaljenost je veća (3700 bp) zbog povećanja gustoće ponavljajućih elemenata. Geni za izlučivanje efektora koji se brzo razvijaju smješteni su u regijama siromašnim genima.
Analiza sekvence genoma P. Infestans pokazala je da približno jedna trećina genoma pripada prenosivim elementima. Genom P. infestans sadrži znatno više različitih porodica transpozona od ostalih poznatih genoma. Većina transpozona P. infestans pripada ciganskoj obitelji.
U genomu P. infestans identificiran je velik broj specifičnih genskih obitelji uključenih u patogenezu. Značajan dio njih kodira efektorske proteine koji mijenjaju fiziologiju biljke domaćina i doprinose njenoj infekciji. Pripadaju dvjema širokim kategorijama: apoplastični efektori koji djeluju u međustaničnim prostorima (apoplasti) i citoplazmatski efektori koji ulaze u stanice putem haustorije. Apoplastični efektori uključuju izlučene hidrolitičke enzime kao što su proteaze, lipaze i glikozilaze koji uništavaju biljne stanice; inhibitori obrambenih enzima biljaka domaćina i nekrotizirajući toksini poput proteina sličnih Nep1 (NPL) i malih proteina bogatih cisteinom sličnih Pcf (SCR).
Učinkoviti geni P. infestans brojni su i obično veći od nepatogenih gena. Najpoznatiji su citoplazmatski efektori RXLR i Crinkler (CNR). Tipični citoplazmatski efektori oomiceta su RXLR proteini. Svi do sada otkriveni efektorski geni RXLR sadrže amino-terminalnu skupinu Arg-XLeu-Arg, gdje je X aminokiselina. Kao rezultat studije sugerirano je da u genomu P. infestans postoje 563 RXLR gena, što je 60% više nego u P. sojae i P. ramorum. Otprilike polovica RXLR gena u genomu P. infestans specifična je za vrstu. RXLR efektori imaju široku paletu sekvenci. Među njima je identificirana jedna velika i 150 malih obitelji. Za razliku od glavnog proteoma, efektorski geni RXLR obično su smješteni u regijama genoma siromašnih i ponavljanjem bogatih regija. Mobilni elementi koji određuju dinamičnost ovih regija olakšavaju rekombinaciju u tim genima.
Citoplazmatski CRN efektori izvorno su identificirani u transkriptima P. infestans koji kodiraju peptide nekroze biljnog tkiva. Od njihovog otkrića malo se zna o obitelji ovih efektora. Analiza genoma P. Infestans otkrila je ogromnu obitelj od 196 CRN gena, koja je mnogo veća od one kod P. sojae (100 CRN) i P. ramorum (19 CRN). Poput RXLR-a, CRN-ovi su modularni proteini i sastoje se od visoko konzervirane N-terminalne LFLAK domene (50 aminokiselina) i susjedne DWL domene koja sadrži različite gene. Većina CRN-ova (60%) posjeduje signalni peptid.
Proučena je mogućnost različitih CRN-ova da poremete stanične procese biljke domaćina. U analizi biljne nekroze, uklanjanjem proteina CRN2 omogućeno je identificiranje C-terminalne regije koja se sastoji od 234 aminokiseline (položaji 173-407, DXG domena) i uzrokuje staničnu smrt. Analiza CRN gena P. infestans otkrila je četiri različita C-terminalna područja, koja također uzrokuju staničnu smrt unutar biljke. Tu spadaju novoidentificirane DC domene (P. Infestans ima 18 gena i 49 pseudogena), kao i D2 (14 i 43) i DBF (2 i 1) domene koje su slične protein kinazama. Proteini CRN domena eksprimirani u biljci konzerviraju se (u nedostatku signalnih peptida) u biljnoj stanici i stimuliraju staničnu smrt unutarćelijskim mehanizmom. Još 255 sljedova koji sadrže CRN domene najvjerojatnije ne funkcioniraju kao geni.
Porast broja i veličine obitelji efektorskih gena RXLR i CRN vjerojatno je posljedica nealelične homologne rekombinacije i umnožavanja gena. Unatoč činjenici da genom sadrži velik broj aktivnih pokretnih elemenata, još uvijek nema izravnih dokaza o prijenosu efektorskih gena.
Metode korištene u proučavanju strukture stanovništva
Proučavanje genetske strukture populacija trenutno se temelji na analizi čistih kultura sastavnih sojeva. Analiza populacija bez izoliranja čistih kultura također se provodi u specifične svrhe, kao što je, na primjer, proučavanje agresivnosti populacije ili prisutnost sojeva otpornih na fungicide u njoj (Filippov i sur., 2004.; Derevyagina i sur., 1999.). Ova vrsta istraživanja uključuje upotrebu posebnih metoda, čiji je opis izvan dosega ovog pregleda. Za usporednu analizu sojeva koriste se brojne metode koje se temelje na analizi strukture DNA i na proučavanju fenotipskih manifestacija. Usporedna analiza populacija mora se nositi s velikim brojem izolata, što nameće određene zahtjeve korištenim metodama. Idealno bi bilo da udovoljavaju sljedećim zahtjevima (Cooke, Lees, 2004., Mueller, Wolfenbarger, 1999.):
- biti jeftini, jednostavni za primjenu, ne zahtijevaju značajne vremenske troškove, temeljiti se na općenito dostupnim tehnologijama (na primjer, PCR);
- moraju generirati dovoljno velik broj neovisnih kodominantnih obilježja markera;
- imaju visoku obnovljivost;
- upotrijebite minimalnu količinu tkiva za ispitivanje;
- biti specifični za supstrat (onečišćenje prisutno u kulturi ne bi trebalo utjecati na rezultate);
- ne zahtijevaju uporabu opasnih postupaka i visoko otrovnih kemikalija.
Nažalost, ne postoje metode koje odgovaraju svim gore navedenim parametrima. Za komparativno proučavanje sojeva u naše vrijeme koriste se metode temeljene na analizi fenotipskih svojstava: virulencija prema sortama krumpira i rajčice (rase krumpira i rajčice), vrsta parenja, spektri izoenzima peptidaze i glukoza-6-fosfat izomeraze, te na analizi strukture DNA: polimorfizam duljine restrikcijski fragment (RFLP), koji se obično nadopunjuje hibridizacijskom sondom RG 57, analizom mikrosatelitskih ponavljanja (SSR i InterSSR), pojačavanjem slučajnim početnicima (RAPD), pojačavanjem restrikcijskih fragmenata (AFLP), pojačavanjem primerima homološnim sekvencama mobilnih elemenata (na primjer, Inter SINE PCR), određivanje haplotipova mitohondrijske DNA.
Kratki opisi metoda komparativnog proučavanja sojeva korištenih u radu s P. Infestansom
Fenotipska obilježja biljega
Utrke "krumpira"
Utrke "krumpir" često su istraživani i korišteni biljezi. Utrke "jednostavnih krumpira" imaju jedan gen za virulenciju krumpira, "složene" - najmanje dva. Black i suradnici (1953.), sažimajući sve podatke koji su im dostupni, otkrili su da je rasa fitoftora sposobna zaraziti biljke genima / genima otpornosti koji odgovaraju genima / genima virulencije P. infestans, te pronašli rase 1, 2, 3 i 4 koje zaraze biljke s genima R1, R2, R3, odnosno R4, tj. interakcija između parazita i domaćina događa se prema principu gena za gen. Dalje, Black je, uz sudjelovanje Galleglyja i Malcolmsona, otkrio gene otpornosti R5, R6, R7, R8, R9, R10 i R11, kao i odgovarajuće rase (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
Postoji opsežna baza podataka o rasnom sastavu patogena iz različitih regija. Bez detaljne analize ovih podataka ukazat ćemo samo na općeniti trend: tamo gdje su korištene sorte s novim genima otpornosti ili njihovim kombinacijama, u početku je došlo do nekog slabljenja kasne plamenjače, no potom su se pojavile i odabrane su rase s odgovarajućim genima virulencije te su nastavljeni napadi na kasnu bolest. Specifična virulencija prema prva 4 gena rezistencije (R1-R4) rijetko je primijećena u kolekcijama prikupljenim prije uvođenja u uzgoj sorti s tim genima, ali broj virulentnih sojeva naglo se povećao kad je patogen parazitirao na sortama koje nose te gene. S druge strane, geni 5-11 bili su prilično česti u kolekcijama (Shaw, 1991.).
Studija o omjeru različitih rasa tijekom vegetacije, provedena krajem 1980-ih, pokazala je da na početku razvoja bolesti u populaciji prevladavaju klonovi s niskom agresivnošću i 1-2 virulentna gena.
Dalje, razvojem kasne bolesti, koncentracija izvornih klonova opada i povećava se broj "složenih" rasa s visokom agresivnošću. Pojava potonjeg do kraja sezone doseže 100%. Prilikom skladištenja gomolja dolazi do smanjenja agresivnosti i gubitka pojedinih gena virulencije. Dinamika zamjene klonova može se pojaviti u različitim sortama na različite načine (Rybakova i Dyakov, 1990). Međutim, naša ispitivanja u razdoblju 2000.-2010. Pokazala su da se složene rase nalaze od samog početka epifitotika među sojevima izoliranim i od krumpira i od rajčice. To je vjerojatno zbog promjena u populaciji P. Infestans u Rusiji.
Do 1988.-1995., Pojava "superrasa" sa svim ili gotovo svim genima virulencije u različitim regijama dosegla je 70-100%. Ova je situacija zabilježena, na primjer, u Bjelorusiji, u Lenjingradskoj i Moskovskoj regiji, u Sjevernoj Osetiji i u Njemačkoj (Ivanyuk i sur., 2002a, 2002b; Polityko, 1994 .; Schober-Butin i sur., 1995.).
Utrke "rajčica"
U sortama rajčice pronađena su samo 2 gena otpornosti na kasnu plamenjaču - Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) i Ph2 (Al-Kherb, 1988). Kao i u slučaju rasa krumpira, interakcija između rajčice i P. infestansa odvija se na osnovi gena po genu. T0 rasa zaražava sorte koje nemaju gene za rezistenciju (većina industrijski korištenih sorti), T1 rasa zaražava sorte s genom Ph1 (Ottawa), a rasa T2 sorte s genom Ph2.
U Rusiji je na krumpiru pronađen gotovo isključivo T0; T0 je na početku sezone dominirao na rajčici, no kasnije ga je zamijenila rasa T1 (Dyakov i sur., 1975., 1994.). Nakon 2000. godine, T1 na krumpiru u mnogim se populacijama počeo javljati na samom početku epifitotskog razdoblja. U Sjedinjenim Državama sojevi krumpira bili su nepatogeni za rajčicu, kao i rase T0, T1 i T2, dok su T1 i T2 prevladavali na rajčici (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin i sur., 1995).
Tip parenja
Za provođenje studije potrebni su ispitivački (referentni) sojevi s poznatim vrstama parenja - A1 i A2. Ispitni izolat inokulira se s njima u parovima u Petrijevim zdjelicama s medijem zobenih agara. Nakon inkubacije tijekom 10 dana, ploče se ispituju na prisutnost ili odsutnost oospora u mediju u kontaktnoj zoni sojeva. Postoje 4 mogućnosti: soj pripada tipu A1 parenja ako tvori oospore s testerom A2, A2, ako oospore tvori tester A1, A1A2, ako tvori oospore s oba testa ili je sterilni (00), ako ne tvori oospore bez ispitivača (posljednje dvije skupine su rijetke).
Kako bi se brže odredile vrste parenja, pokušani su identificirati regije genoma povezane s vrstom parenja, s ciljem njihove daljnje upotrebe za određivanje vrste parenja pomoću PCR-a. Američki su istraživači proveli jedan od prvih uspješnih eksperimenata za identificiranje takvog mjesta (Judelson i sur., 1995.). Koristeći RAPD metodu, uspjeli su identificirati područje W16 povezano s tipom parenja u potomstvu dvaju ukrštenih izolata i osmisliti par početnih slojeva od 24 bp za njegovo pojačavanje (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') i W16-2 (5' -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') Nakon restrikcije PCR proizvoda restrikcijskim enzimom HaeIII, bilo je moguće razdvojiti izolate s uparivanjem tipova A1 i A2.
Korejski su istraživači poduzeli još jedan pokušaj dobivanja PCR markera za određivanje vrsta parenja (Kim, Lee, 2002). Identificirali su određene proizvode pomoću AFLP metode. Kao rezultat toga, razvijen je par početnica PHYB-1 (naprijed) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') i PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3'), što omogućuje selektivno pojačavanje genomske regije povezane s tipom parenja A2. Nakon toga nastavili su s ovim radom i dizajnirali početnice 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, naprijed) i 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), omogućavajući selektivno pojačavanje Mat-A1 područja karakterističnog za sojeve s tipom parenja. A1. Korištenje PCR dijagnostike tipova parenja pokazalo je dobre rezultate u proučavanju populacija P. infestans u Češkoj (Mazakova i sur., 2006.), Tunisu (Jmour, Hamada, 2006.) i drugim regijama. U našem laboratoriju (Mytsa, Elansky, neobjavljeno) analizirani su 34 sojevi P. infestans izolirani iz oboljelih organa krumpira i rajčice u različitim regijama Rusije (Kostroma, Rjazanj, Astrahan i Moskva). Rezultati PCR analize korištenjem specifičnih početnica više od 90% podudarali su se s rezultatima analize vrste parenja tradicionalnom metodom na hranjivom mediju.
Tablica 1. Varijabilnost rezistencije unutar klona Sib 1 (Elansky i sur., 2001.)
Mjesto uzimanja uzoraka | Broj analiziranih izolata | Broj osjetljivih (S), slabo otpornih (SR) i rezistentnih (R) sojeva, kom (%) | ||
S | SR | R | ||
G. Vladivostok | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
G. Chita | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Irkutsk | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
G. Krasnojarsk | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Grad Jekaterinburg | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
O. Sahalin | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Regija Omsk | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Otpornost na metalaksil kao populacijski marker
Početkom 1980-ih u raznim su regijama zabilježeni snažni napadi kasne plamenje izazvane sojevima P. infestans otpornih na metalaksil. Farme krumpira u mnogim zemljama pretrpjele su značajne gubitke (Dowley i O'Sullivan, 1981; Davidse i sur., 1983; Derevyagina, 1991). Od tada se u mnogim zemljama svijeta provodi stalno praćenje pojave sojeva otpornih na fenilamid u populacijama P. infestans. Uz praktičnu procjenu izgleda za uporabu lijekova koji sadrže fenilamide, izgradnju sustava zaštitnih mjera i predviđanje epifitoza, rezistencija na ove lijekove postala je jedno od obilježja koja se široko koriste za usporednu analizu populacija ovog patogena. Međutim, uporabu rezistencije na metalaksil u usporednim populacijskim istraživanjima treba provesti uzimajući u obzir činjenicu da: 1 - genetska osnova rezistencije još nije precizno utvrđena, 2 - rezistencija na metalaksil selektivno je ovisna osobina koja može varirati ovisno o upotrebi fenilamida, 3 - različita stupanj osjetljivosti na sojeve metalaksila unutar jedne klonske linije (tablica. 1).
Spektri izozima
Izozimski biljezi obično su neovisni o vanjskim uvjetima, pokazuju mendelovsko nasljeđe i kodominantni su, što omogućuje razlikovanje homo- i heterozigota. Korištenje bjelančevina kao genskih biljega omogućuje identificiranje i velikih reorganizacija genetskog materijala, uključujući kromosomske i genomske mutacije, i zamjenu pojedinačnih aminokiselina.
Elektroforetska ispitivanja proteina pokazala su da većina enzima postoji u organizmima u obliku nekoliko frakcija koje se razlikuju u elektroforetskoj pokretljivosti. Te su frakcije rezultat kodiranja više oblika enzima različitim lokusima (izozimima ili izozimima) ili različitim alelima istog lokusa (alozimima ili aloenzimima). Odnosno, izoenzimi su različiti oblici jednog enzima. Različiti oblici imaju isto katalitičko djelovanje, ali se malo razlikuju u zamjenama pojedinih aminokiselina u peptidu i u zaduženom. Takve se razlike otkrivaju tijekom elektroforeze.
U proučavanju sojeva P. infestans koriste se spektri izoenzima dvaju proteina, peptidaze i glukoza-6-fosfat izomeraze (ovaj enzim je monomorfan u ruskim populacijama, stoga metode njegovog proučavanja nisu predstavljene u ovom radu). Da bi se razdvojili u izoenzime u električnom polju, proteinski pripravci izolirani od ispitivanih organizama nanose se na gel pločicu smještenu u električno polje. Brzina difuzije pojedinih bjelančevina u gelu ovisi o naboju i molekularnoj masi, stoga se u električnom polju smjesa bjelančevina razdvaja u zasebne frakcije, koje se mogu vizualizirati pomoću posebnih boja.
Ispitivanje izoenzima peptidaze provodi se na celulozno-acetatnim, škrobnim ili poliakrilamidnim gelovima. Najprikladnija je metoda koja se temelji na korištenju celuloznih acetatnih gelova proizvođača Helena Laboratories Inc. Ne zahtijevaju velike količine ispitnih materijala, omogućuje se dobivanje kontrastnih traka na gelu nakon elektroforeze za oba enzimska lokusa, njegova provedba ne zahtijeva velike vremenske i materijalne troškove (slika 2).
Mali komad micelija premjesti se u mikrocijev od 1,5 ml, doda mu se 1-2 kapi destilirane vode. Nakon toga, uzorak se homogenizira (na primjer, električnom bušilicom s plastičnim nastavkom prikladnim za mikrocijev) i taloži 25 sekundi na centrifugi pri 13000 o / min. 8 μl iz svake mikrocijevi. supernatant se prenosi na pločicu aplikatora.
Celulozni acetatni gel uklanja se iz spremnika pufera, upija između dva lista filtrirnog papira i postavlja radnim slojem na plastičnu podlogu aplikatora. Otopinu s ploče aplikator prenosi na gel 2-4 puta. Gel se prenosi u komoru za elektroforezu,
Tablica 2. Sastav otopine koja se koristi za bojenje celuloznog acetata u analizi izoenzima peptidaze, kap boje (bromofenol plava) stavi se na rub gela.
TRIS HCl, 0,05 M, Ph 8,0 2 ml
Peroksidaza, 1000 U / ml 5 kapi
o-dianisidin, 4 mg / ml 8 kapi
MgCl2, 20 mg / ml 2 kapi
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 kapi
L-aminokiselinska oksidaza, 20 u / ml 2 kapi
Elektroforeza se provodi 20 minuta. na 200 V. Nakon elektroforeze, gel se prebaci na slikarski stol i oboji posebnom otopinom za bojanje (tablica 2). 10 ml 1,6% DIFCO agara prethodno se otopi u mikrovalnoj pećnici, ohladi na 60 ° C, nakon čega se 2 ml agara pomiješa sa smjesom boje i ulije u gel. Pruge se pojavljuju u roku od 15-20 minuta. Reagent L-aminokiselinske oksidaze dodaje se neposredno prije miješanja otopine s rastopljenim agarom.
U ruskim populacijama lokus Pep 1 predstavljen je genotipovima 100/100 i 92/100. Homozigot 92/92 izuzetno je rijedak (oko 0,1%). Locus Rehr 2 predstavljen je s tri genotipa 100/100, 100/112 i 112/112, a sve su 3 varijante prilično česte (Elanky i Smirnov, 2003, slika 2).
Istraživanje genoma
Polimorfizam duljine restrikcijskog fragmenta s naknadnom hibridizacijom (RFLP-RG 57)
Ukupna DNA obrađuje se restrikcijskim enzimom Eco R1, fragmenti DNA odvajaju se elektroforezom u agaroznom gelu. Nuklearna DNA vrlo je velika i ima mnogo ponavljajućih sekvenci, što otežava izravnu analizu brojnih fragmenata dobivenih djelovanjem restrikcijskih enzima. Stoga se fragmenti DNA odvojeni u gelu prenose u posebnu membranu i koriste za hibridizaciju sondom RG 57, koja uključuje nukleotide obilježene radioaktivnim ili fluorescentnim oznakama. Ova sonda hibridizira s ponavljajućim genomskim sekvencama (Goodwin i sur., 1992., Forbes i sur., 1998.). Nakon vizualizacije rezultata hibridizacije na svjetlosnom ili radioaktivnom materijalu, dobiva se multilokusni profil hibridizacije (otisak prsta), predstavljen s 25-29 fragmenata (Forbes i sur., 1998). Aseksualni (klonski) potomci imat će iste profile. Po rasporedu traka na elektroforetogramu mogu se prosuditi sličnosti i razlike uspoređenih organizama.
Haplotipovi mitohondrijske DNA
U većini eukariotskih stanica mtDNA je predstavljena u obliku dvolančane kružne molekule DNA koja se, za razliku od nuklearnih kromosoma eukariotskih stanica, polukonzervativno replicira i nije povezana s molekulama proteina.
Sekvenciran je mitohondrijski genom P. infestans, a niz je radova bio posvećen analizi duljina restrikcijskih fragmenata (Carter i sur., 1990., Goodwin, 1991., Gavino, Fry, 2002.). Nakon što su Griffith i Shaw (1998) razvili jednostavnu i brzu metodu za određivanje mtDNA haplotipova, ovaj je marker postao jedan od najpopularnijih u istraživanjima P. Infestansa. Suština metode sastoji se u sekvencijalnoj amplifikaciji dva fragmenta mitohondrijske DNA (iz zajedničkog genoma) s početnicama F2-R2 i F4-R4 (tablica 3) i njihova naknadna restrikcija restrikcijskim enzimima MspI (1. fragment) i EcoR1 (2. fragment). Metoda vam omogućuje identificiranje 4 haplotipa: Ia, IIa, Ib, IIb. Tip II razlikuje se od tipa I prisutnošću umetka od 1881 bp i drugačijim mjestom restrikcijskih mjesta u P2 i P4 regijama (slika 3).
Od 1996. godine među sojevima prikupljenim na teritoriju Rusije zabilježeni su samo haplotipovi Ia i IIa (Elansky i sur., 2001., 2015.). Oni se mogu identificirati nakon razdvajanja restrikcijskih proizvoda s primerom F2-R2 u električnom polju (slika 4, 5). Vrste mtDNA koriste se u usporednoj analizi sojeva i populacija. U brojnim istraživanjima tipovi mitohondrijske DNA korišteni su za izolaciju klonskih linija i pasportizaciju izolata P. infestans (Botez i sur., 2007.; Shein i sur., 2009.). Korištenjem PCR-RFLP metode zaključeno je da je mtDNA heterogena u istom soju P. infestans (Elansky i Milyutina, 2007). Uvjeti pojačanja: 1x (500 sek. 94 ° C), 40x (30 sek. 90 ° C, 30 sek. 52 ° C, 90 sek. 72 ° C); 1x (5 min. 72 ° C). Reakcijska smjesa: (20 μl): 0,2 U Taq DNA polimeraze, 1x 2,5 mM pufera MgCl2-Taq, 0,2 mM svaki dNTP, 30 pM početnice i 5 ng analizirane DNA, deionizirana voda - do 20 μl.
Ograničenje PCR proizvoda provodi se 4-6 sati na temperaturi od 37 ° C. Restrikcijska smjesa (20 μl): 10x MspI (2 μl), 10x restrikcijski pufer (2 μl), deionizirana voda (6 μl), PCR proizvod (10 μl).
Tablica 3. Primeri koji se koriste za amplifikaciju polimorfnih regija mtDNA
Mjesto | fitilj | Duljina i raspored temeljnog premaza | Duljina PCR proizvoda | Restrictase |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21; 13619-13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22; 14688-14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22; 9329-9350 | 964 | EcoRI |
R4:5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22; 10292-10271 |
Slučajno pojačavanje temeljnog premaza (RAPD)
Pri provođenju RAPD koristi se jedan primer (ponekad i nekoliko početnica istovremeno) s proizvoljnim nukleotidnim redoslijedom, obično 10 nukleotida duljine, s visokim sadržajem (od 50%) GC nukleotida i niskom temperaturom žarenja (oko 35 ° C). Takvi početnici "slijeću" na brojna komplementarna mjesta u genomu. Nakon pojačanja dobiva se velik broj amplikona. Njihov broj ovisi o upotrijebljenim temeljnim premazima i reakcijskim uvjetima (koncentracija MgCl2 i temperatura žarenja).
Vizualizacija amplikona vrši se destilacijom u poliakrilamidu ili agaroznom gelu. Prilikom provođenja RAPD analize potrebno je pažljivo pratiti čistoću analiziranog materijala, jer onečišćenje drugim živim objektima može uzrokovati značajan porast broja artefakata, koji su prilično brojni u analizi čistog materijala (Perez i sur., 1998). Upotreba ove metode u proučavanju genoma P. infestans ogleda se u mnogim radovima (Judelson, Roberts, 1999, Ghimire i sur., 2002, Carlisle i sur., 2001). Odabir reakcijskih uvjeta i početnika (proučavan je 51 početnik s 10 nukleotida) u članku su dali Abu-El Samen i sur. (2003).
Analiza mikrosatelitskog ponavljanja (SSR)
Mikrosatelitska ponavljanja (jednostavna ponavljanja sekvenci, SSR) tandemno ponavljaju kratke sekvence 1-3 (ponekad i do 6) nukleotida prisutnih u nuklearnim genomima svih eukariota. Broj uzastopnih ponavljanja može varirati od 10 do 100. Mikrosatelitski lokusi javljaju se s prilično visokom frekvencijom i manje-više su ravnomjerno raspoređeni po genomu (Lagercrantz i sur., 1993). Polimorfizam mikrosatelitskih sekvenci povezan je s razlikama u broju ponavljanja osnovnog motiva. Mikrosatelitski biljezi su kodominantni, što omogućuje njihovu upotrebu za analizu strukture populacije, određivanje srodstva, putova migracije genotipa itd. Među ostalim prednostima ovih biljega treba istaknuti njihov visoki polimorfizam, dobru reproduktivnost, neutralnost i sposobnost automatske analize i procjene. Analiza polimorfizma mikrosatelitskih ponavljanja provodi se PCR pojačavanjem korištenjem primera komplementarnih jedinstvenim sljedovima koji prate bočne mikrosatelitske lokuse. U početku je analiza provedena odvajanjem reakcijskih produkata na poliakrilamidnom gelu. Kasnije su zaposlenici tvrtke Applied Biosystems predložili upotrebu fluorescentno označenih primera s detekcijom reakcijskih produkata pomoću automatskog laserskog detektora (Diehl i sur., 1990.), a zatim i standardnih automatskih DNA sekvencera (Ziegle i sur., 1992.). Označavanje temeljnih premaza različitim fluorescentnim bojama omogućuje vam analizu nekoliko markera odjednom na jednoj traci i, u skladu s tim, značajno povećavaju produktivnost metode i poboljšavaju točnost analize.
Prve publikacije posvećene upotrebi SSR analize za proučavanje P. infestans pojavile su se početkom 2000-ih. (Knapova, Gisi, 2002). Nisu svi markeri koje su predložili autori pokazali dovoljan stupanj polimorfizma, međutim, dva od njih (4B i G11) bila su uključena u skup od 12 SSR markera koje su predložili Lees i suradnici (2006), a potom usvojeni u istraživačkoj mreži Eucablight (www.eucablight .org) kao standard za P. infestans. Nekoliko godina kasnije objavljena je studija o stvaranju sustava za multipleksnu analizu DNA P. infestans na temelju osam SSR markera (Li i sur., 2010.). Konačno, nakon procjene svih prethodno predloženih markera i odabira najinformativnijeg od njih, kao i optimizacije početnih slojeva, fluorescentnih naljepnica i uvjeta pojačanja, ista je skupina autora predstavila sustav multipleksiranja u jednom koraku, uključujući 12 markera (Tablica 4; Li i sur. , 2013a). Primeri korišteni u ovom sustavu odabrani su i označeni jednim od četiri fluorescentna biljega (FAM, VIC, NED, PET), tako da se rasponi veličina alela početnica s istim oznakama ne preklapaju.
Autori su izveli analizu na PTC200 pojačalu (MJ Research, USA) koristeći QIAGEN multiplex PCR setove ili QIAGEN Typeit Microsatellite PCR setove. Volumen reakcijske smjese bio je 12.5 μL. Uvjeti pojačanja bili su sljedeći: za QIAGEN multiplex PCR: 95 ° C (15 min), 30x (95 ° C (20 s), 58 ° C (90 s), 72 ° C (60 s), 72 ° C (20 min); za QIAGEN Type-it Microsatellite PCR: 95 ° C (5 min), 28x (95 ° C (30 sek.), 58 ° C (90 sek.), 72 ° C (20 sek.), 60 ° C (30 min.).
Razdvajanje i vizualizacija PCR proizvoda izvedeni su pomoću ABI3730 automatskog kapilarnog DNA analizatora (Applied Biosystems).
Tablica 4. Karakteristike 12 standardnih SSR markera koji se koriste za genotipizaciju P. Infestans (Li i sur., 2013.a)
ime | Broj alela | Raspon veličina aleli (bp) | Grundi |
PiG11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
ft02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTTACAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | FAM-TCTTGTTCGAGTATGGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
ft04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
ft70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
ft63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGAG |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R: GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
Primjer vizualizacije rezultata analize prikazan je na sl. 6. Rezultati su analizirani pomoću softvera GeneMapper 3.7 uspoređivanjem dobivenih podataka s podacima poznatih izolata. Da bi se olakšala interpretacija rezultata analize, u svaku je studiju potrebno uključiti 1-2 referentna izolata s poznatim genotipom.
Predložena metoda istraživanja testirana je na značajnom broju terenskih uzoraka, nakon čega su autori standardizirali protokole između laboratorija dviju organizacija, James Hutton Institute (UK) i Wageningen University & Research (Nizozemska), koji su, uz mogućnost korištenja standardnih FTA kartica za pojednostavljene prikupljanje i otprema uzoraka DNK P. infestans omogućilo je da se govori o mogućnosti komercijalne uporabe ovog razvoja. Uz to, brza i precizna metoda genotipiziranja izolata P. infestans korištenjem multiplex SSR analize omogućila je provođenje standardiziranih studija populacija ovog patogena na globalnoj razini i stvaranje svjetske baze podataka o kasnoj bolesti u okviru projekta Eucablight (www.eucablight.org), uključujući , uključujući rezultate mikrosatelitske analize, omogućilo je praćenje pojave i širenja novih genotipova širom svijeta.
Pojačani polimorfizam duljine restrikcijskog fragmenta (AFLP). AFLP (pojačani polimorfizam duljine fragmenta) tehnologija je za generiranje slučajnih molekularnih markera pomoću specifičnih početnika. U AFLP, DNA se liječi kombinacijom dva restrikcijska enzima. Određeni adapteri povezani su na ljepljive krajeve restrikcijskih fragmenata.
Ti se fragmenti zatim pojačavaju pomoću primera komplementarnih adaptacijskoj sekvenci i restrikcijskom mjestu, a dodatno nose jednu ili više slučajnih baza na njihovim 3 'krajevima. Skup dobivenih fragmenata ovisi o restrikcijskim enzimima i slučajno odabranim nukleotidima na 3'-krajevima početnica (Vos i sur., 1995). AFLP - genotipizacija se koristi za brzo proučavanje genetskih varijacija različitih organizama.
Detaljan opis metode dan je u radovima Mueller, Wolfenbarger, 1999, Savelkoul i sur., 1999. Kineski su istraživači izveli mnogo rada na usporedbi rezolucije AFLP i SSR metoda. Proučene su fenotipske i genotipske značajke 48 izolata P. infestans prikupljenih u pet regija sjeverne Kine. AFLP spektri otkrili su osam različitih DNA genotipova, za razliku od SSR genotipova, za koje nije pronađena raznolikost (Guo i sur., 2008).
Pojačanje primerima homolognim sljedovima pokretnih elemenata
Markeri izvedeni iz sekvenci retrotranspozona vrlo su prikladni za genetsko mapiranje, proučavanje genetske raznolikosti i evolucijske procese (Schulman, 2006). Ako su prajmeri napravljeni da nadopunjuju stabilne sekvence određenih mobilnih elemenata, moguće je pojačati regije genoma smještene između njih. U istraživanjima uzročnika kasne plamenje uspješno je primijenjena metoda pojačavanja dijelova genoma primjerom primera koji je komplementaran jezgrenom slijedu retropazona SINE (kratki interspersed nuklearni elementi) (Lavrova i Elansky, 2003). Korištenjem ove metode otkrivene su razlike čak i kod nespolnih potomaka jednog izolata. S tim u vezi zaključeno je da je inter-SINE - PCR metoda vrlo specifična i da je brzina kretanja SINE elemenata u genomu Phytophthora velika.
U genomu P. infestans identificirano je 12 obitelji kratkih retrotranspozona (SINE); istražena je raspodjela vrsta kratkih retrotranspozona; identificirani su elementi (SINE) koji se nalaze u genomu samo P. infestans (Lavrova, 2004).
Značajke primjene metoda komparativnog proučavanja sojeva u populacijskim istraživanjima
Pri planiranju studije potrebno je jasno razumjeti ciljeve kojima se teži i koristiti odgovarajuće metode. Dakle, neke metode omogućuju stvaranje velikog broja neovisnih obilježja markera, ali istodobno imaju nisku obnovljivost i snažno ovise o korištenim reagensima, uvjetima reakcije i onečišćenju ispitivanog materijala. Stoga je u svakom ispitivanju skupine sojeva potrebno koristiti nekoliko standardnih (referentnih) izolata, ali čak je i u ovom slučaju vrlo teško kombinirati rezultate nekoliko pokusa.
Ova skupina metoda uključuje RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Nakon amplifikacije dobiva se velik broj fragmenata DNA različitih veličina. Preporučljivo je koristiti takve tehnike kada je potrebno utvrditi razlike između blisko povezanih sojeva (roditelj-potomci, divlji mutanti itd.) Ili u slučajevima kada je potrebna detaljna analiza malog uzorka. Stoga se AFLP metoda široko koristi u genetskom mapiranju P. infestans (van der Lee i sur., 1997.) i u interpopulacijskim istraživanjima (Knapova, Gisi, 2002., Cooke i sur., 2003., Flier i sur., 2003.). Takve metode je nepraktično koristiti prilikom stvaranja baza podataka sojeva, budući da praktički je nemoguće objediniti računovodstvo rezultata prilikom provođenja analiza u različitim laboratorijima.
Unatoč naizgled jednostavnosti i brzini izvođenja (izolacija DNA bez dobrog pročišćavanja, pojačavanja, vizualizacije rezultata), ova skupina metoda zahtijeva upotrebu posebne metode za dokumentiranje rezultata: destilacija u poliakrilamidnom gelu s označenim (radioaktivnim ili luminiscentnim) početnicama i naknadno izlaganje svjetlu ili radioaktivnom materijalu. Uobičajena snimanja etidij-bromid-agaroznog gela uglavnom nisu prikladna za ove metode jer može se stopiti velik broj fragmenata DNA različitih veličina.
Druge metode, naprotiv, omogućuju generiranje malog broja značajki s njihovom vrlo visokom obnovljivošću. Ova skupina uključuje proučavanje haplotipova mitohondrijske DNA (u Rusiji su zabilježena samo dva haplotipa Ia i IIa), tipa parenja (većina izolata podijeljena je na 2 tipa: A1 i A2, samooplodni SF se rijetko nalazi) i izoptidni spektri peptidaze (dva lokusa Pep1 i Pep2 , koji se sastoji od po dva izozima) i glukoza-6-fosfat izomeraze (u Rusiji nema varijabilnosti u ovoj osobini, iako je značajan polimorfizam zabilježen u drugim zemljama svijeta). Preporučljivo je koristiti ove značajke prilikom analize zbirki, sastavljanja regionalnih i globalnih baza podataka. U slučaju analize izozima i haplotipova mitohondrijske DNA moguće je uopće bez standardnih sojeva, dok su u analizi tipova parenja potrebna dva test izolata s poznatim tipovima parenja.
Uvjeti reakcije i reagensi mogu utjecati samo na kontrast proizvoda na elektroforetogramu; očitovanje artefakata u ovim vrstama studija je malo vjerojatno.
Trenutno su većina populacija u europskom dijelu Rusije predstavljene sojevima obje vrste parenja (tablica 6.), među njima postoje izolati s tipovima Ia i IIa mitohondrijske DNK (druge vrste mtDNA pronađene u svijetu nisu nađene u Rusiji nakon 1993. godine). Spektri izoenzima peptidaze predstavljeni su s dva genotipa na lokusu Pep1 (100/100, 92/92 i heterozigoti 92/100, a genotip 92/92 izuzetno je rijedak (<0,3%)) i dva genotipa na lokusu Pep 2 (100/100 , 112/112 i heterozigota 100/112, s genotipom 112/112 koji se javlja rjeđe od 100/100, ali i prilično često).
Nije bilo varijabilnosti u spektru izozima enzima glukoza-6-fosfat izomeraze nakon 1993. godine (nestanak klonske linije US-1); svi ispitivani izolati imali su genotip 100/100 (Elansky i Smirnov, 2002).
Treća skupina metoda omogućuje dobivanje dovoljne skupine neovisnih obilježja markera s visokom obnovljivošću. Danas ova skupina uključuje sondu RFLP-RG57 koja proizvodi 25-29 fragmenata DNA različitih veličina. RFLP-RG57 se može koristiti i za analizu uzoraka i za sastavljanje baza podataka. Međutim, ova je metoda mnogo skuplja od prethodnih, dugotrajna je i zahtijeva dovoljno veliku količinu visoko pročišćene DNA. Stoga je istraživač prisiljen ograničiti količinu ispitivanog materijala.
Razvoj RFLP-RG57 početkom 90-ih godina prošlog stoljeća značajno je intenzivirao populacijske studije uzročnika kasne bolesti. Postala je osnova metode koja se temelji na odabiru i analizi "Klonskih linija" (vidi dolje). Zajedno s RFLP-RG57, za identifikaciju klonskih linija koriste se tip parenja, DNK otisci prstiju (RFLP-RG57 metoda), spektri izoenzima peptidaze i glukoza-6-fosfat izomeraze te mitohondrijski DNK. Zahvaljujući njemu, pokazalo se al., 1994.), zamjena starih populacija novim (Drenth i sur., 1993., Sujkowski i sur., 1994., Goodwin i sur., 1995.), otkrila je klonske linije koje prevladavaju u mnogim zemljama svijeta. Studije ruskih sojeva korištenjem ove metode pokazale su visok genotipski polimorfizam sojeva europskog dijela i monomorfizam populacija azijskih i dalekoistočnih dijelova Rusije (Elansky i sur, 2001.). I sada ova metoda ostaje glavna u populacijskim istraživanjima P. infestans. Međutim, njegovu široku distribuciju ometaju prilično visoki troškovi i intenzitet rada u izvršenju.
Još jedna obećavajuća tehnika koja se rijetko koristi u istraživanjima P. infestans je analiza mikrosatelitskog ponavljanja (SSR). Trenutno se ova metoda široko koristi za izolaciju klonskih linija. Za analizu sojeva široko su korištene (i dalje se koriste) takve fenotipske bilježne osobine kao što su prisutnost gena virulencije za sorte krumpira (Avdey, 1995, Ivanyuk i sur., 2002, Ulanova i sur., 2003) i rajčice. Do sada su geni za virulenciju prema sortama krumpira izgubili vrijednost kao obilježja obilježja za populacijske studije zbog pojave maksimalnog (ili blizu njega) broja gena virulencije u velikoj većini izolata. Istodobno, gen virulencije T1 za sorte rajčice koji nose odgovarajući gen Ph1 i dalje se uspješno koristi kao obilježje biljega (Lavrova i sur., 2003.; Ulanova i sur., 2003.).
U mnogim studijama, rezistentnost na fungicide koristi se kao biljeg. Ova je osobina nepoželjna za upotrebu u populacijskim ispitivanjima zbog prilično lagane pojave mutacija rezistencije na klonskim linijama nakon primjene fungicida koji sadrže metalaksil- (ili mefenoksam-) na terenu. Na primjer, značajne razlike u razini otpornosti pokazane su unutar klonske linije Sib1 (Elansky i sur., 2001.).
Dakle, tipovi parenja, spektri izoptima peptidaze, tip mitohondrijske DNA, RFLP-RG57, SSR poželjni su biljezi za stvaranje banaka podataka i obilježavanje sojeva u zbirkama. Za usporedbu ograničenih uzoraka, ako je potrebno koristiti maksimalan broj značajki markera, možete koristiti AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR (Tablica 5). Međutim, treba imati na umu da se ove metode slabo mogu reproducirati, te je u svakom pojedinačnom eksperimentu (ciklus pojačavajuće elektroforeze) potrebno koristiti nekoliko referentnih izolata.
Tablica 5. Usporedba različitih metoda istraživanja sojeva P. infestans
Kriterij | TC | Policajci Isofer | mtDNA | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | revolucija |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Količina informacija | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Ponovljivost | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Mogućnost artefakata | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
trošak | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Intenzitet rada | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
Brzina analize ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Napomena: H - nisko, C - srednje, B - visoko; NS * - intenzitet rada je nizak kada se koristi agarozni gel ili automatski
genotiper, medij - destilacijom u poliakrilamidnom gelu s označenim prajmerima,
** - ne računajući vrijeme provedeno na uzgoju micelija za izolaciju DNA.
Struktura stanovništva
Klonske crte
U nedostatku rekombinacije ili njenog beznačajnog doprinosa strukturi populacije, populacija se sastoji od određenog broja klonova, između kojih su genetske razmjene izuzetno rijetke.
U takvim je populacijama informativnije proučavati ne frekvencije pojedinačnih gena, već frekvencije genotipova koji imaju zajedničko podrijetlo (klonske linije ili klonske loze), a razlikuju se samo u točkovnim mutacijama. Studije stanovništva patogena kasne plamenje i analiza klonskih linija značajno su se ubrzale od pojave RFLP-RG57 metode ranih 90-ih godina prošlog stoljeća. Zajedno s RFLP-RG57, tipovi parenja, spektri izoenzima peptidaze i glukoza-6-fosfat izomeraze i mitohondrijski DNK koriste se za identifikaciju klonskih linija. Karakteristike najčešćih klonskih linija prikazane su u tablici 6.
Klonirali su populacije SAD-1 posvuda sve do kraja 80-ih, nakon čega su je počeli zamijeniti drugi klonovi i nestati iz Europe i Sjeverne Amerike. Sada se nalazi na Dalekom istoku (Filipini, Tajvan, Kina, Japan, Koreja, Koh i sur., 1994., Mosa i sur., 1993.), u Africi (Uganda, Kenija, Ruanda, Goodwin i sur., 1994., Vega-Sanchez et al., 2000; Ochwo i sur., 2002) i u Južnoj Americi (Ekvador, Brazil, Peru, Forbes i sur., 1997, Goodwin i sur., 1994). Samo u Australiji nisu identificirani sojevi koji pripadaju liniji US-1. Očito su izolati P. infestans došli u Australiju s drugim valom migracije (Goodwin, 1997).
Klon US-6 migrirao je iz sjevernog Meksika u Kaliforniju krajem 70-ih i izazvao epidemiju krumpira i rajčice nakon 32 godine bez bolesti. Zbog svoje visoke agresivnosti istisnuo je klon US-1 i počeo dominirati na zapadnoj obali Sjedinjenih Država (Goodwin i sur., 1995.).
Genotipovi US-7 i US-8 otkriveni su u Sjedinjenim Državama 1992. godine, a već 1994. godine široko su rasprostranjeni u Sjedinjenim Državama i Kanadi. Tijekom jedne poljske sezone klon US-8 u stanju je gotovo u potpunosti istisnuti klon US-1 na parcelama krumpira u početku zaraženim s oba klona u jednakoj koncentraciji (Miller i Johnson, 2000).
Klonovi BC-1 do BC-4 identificirani su u Britanskoj Kolumbiji u malom broju izolata iz Goodwina i sur., 1995b). Klon US-11 široko se proširio u Sjedinjenim Državama i istisnuo US-1 na Tajvanu. Klonovi JP-1 i EC-1, zajedno s klonom US-1, česti su u Japanu, odnosno Ekvadoru (Koh i sur., 1994 .; Forbes i sur., 1997.).
SIB-1 je klon koji je u Rusiji prevladavao na ogromnom teritoriju od Moskovske regije do Sahalina. U Moskovskoj regiji otkriven je 1993. godine, a neke su se poljske populacije uglavnom sastojale od sojeva ove klonske linije, vrlo otpornih na metalaksil. Nakon 1993. godine, prevalencija ovog klona značajno se smanjila. Izvan Urala u razdoblju 1997.-1998., SIB-1 je pronađen svugdje, s izuzetkom teritorija Habarovsk (tamo je raširen klon SIB-2). Prostorno razdvajanje klonova s različitim vrstama parenja isključuje spolni proces u Sibiru i na Dalekom Istoku. U Moskovskoj regiji, za razliku od Sibira, stanovništvo je predstavljeno mnogim klonovima; gotovo svaki izolat ima jedinstveni multilokusni genotip (Elansky i sur., 2001., 2015.). Ova se raznolikost ne može objasniti samo uvozom sojeva gljivica iz različitih dijelova svijeta s uvoznim sjemenskim materijalom. Budući da se obje vrste parenja javljaju u populaciji, moguće je da je za njegovu raznolikost zaslužna i rekombinacija. Dakle, u Britanskoj Kolumbiji pretpostavlja se pojava genotipova BC-2, BC-3 i BC-4 zbog hibridizacije klonova BC-1 i US-6 (Goodwin i sur., 1995b). Moguće je da se hibridni sojevi nalaze u populacijama Moskve. Na primjer, sojevi MO-4, MO-8 i MO-11 heterozigotni za PEP lokus mogu biti hibridi između sojeva MO-12, MO-21, MO-22, koji imaju A2 tip uparivanja i homozigoti za jedan alel PEP lokusa i soja MO-8, koji ima A1 tip parenja i homozigotan za drugi alel lokusa. A ako je to tako, a u modernim populacijama P. infestans postoji tendencija povećanja uloge spolnog procesa, tada će se informacijska vrijednost analize multilokusnih klonova smanjiti (Elansky i sur., 2001., 2015.).
Varijacija u klonskim linijama
Do 90-ih godina 20. stoljeća klonska linija US-1 bila je raširena u svijetu. Većina poljske i regionalne populacije sastojala se isključivo od sojeva s genotipom US-1. Međutim, uočene su i razlike između izolata, najvjerojatnije uzrokovane mutacijskim postupkom. Mutacije su se dogodile i u nuklearnoj i u mitohondrijskoj DNA i utjecale su, između ostalog, na razinu otpornosti na lijekove s fenilamidom i na broj gena virulencije. Linije koje se razlikuju od izvornih genotipova mutacijama označene su dodatnim brojevima nakon točke nakon naziva izvornog genotipa (na primjer, mutirana linija US-1.1 klonske linije US-1). DNK linije za uzimanje otisaka prstiju US-1.5 i US-1.6 sadrže pomoćne linije različitih veličina (Goodwin i sur., 1995a, 1995b); klonska linija US-6.3 također se razlikuje od US-6 po jednoj dodatnoj liniji (Goodwin, 1997, tablica 7).
U proučavanju mitohondrijske DNA utvrđeno je da se u klonskoj liniji US-1 nalazi samo mitohondrijska DNA tipa 1b (Carter i sur., 1990). Međutim, u proučavanju sojeva ove klonske loze iz Perua i Filipina pronađeni su izolati čiji su se mitohondrijski tipovi DNA razlikovali od 1b u prisutnosti insercija i delecija (Goodwin, 1991., Koh i sur., 1994.).
Tablica 6. Multilokusni genotipovi nekih klonskih linija P. infestans
ime | Tip parenja | Izozimi | DNK otisci prstiju | MtDNA tip | |
GPI | PEP | ||||
Američko-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011 + 24 | Ib |
Američko-2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011 + 24 | - |
Američko-3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011 + 24 | - |
Američko-4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011 + 24 | - |
Američko-5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011 + 24 | - |
Američko-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011 + 24 | IIb |
Američko-7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011 + 24 | Ia |
Američko-8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011 + 24 | Ia |
Američko-9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
Američko-10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
Američko-11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011 + 24 | IIb |
Američko-12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | - |
Američko-14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011 + 24 | - |
Američko-15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | Ia |
Američko-16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011 + 24 | - |
Američko-17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011 + 24 | - |
Američko-18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | Ia |
Američko-19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011 + 24 | Ia |
EZ-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011 + 24 | IIa |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 + 24 | IIa |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 + 24 | IIa |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011 + 24 | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 + 24 | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011 + 24 | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011 + 24 | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011 + 24 | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011 + 24 | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011 + 24 | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011 + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011 + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011 + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011 + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011 + 24 | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011 + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011 + 24 | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | IIa |
Napomena: * - nema podataka.
Tablica 7. Multilokusni genotipovi i njihove mutirane linije
ime | Tip parenja | | DNK otisci prstiju (RG57) | Bilješke | |
GPI | PEP-1 | ||||
Američko-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Izvorni genotip 1 |
Američko-1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Mutacija u PEP |
Američko-1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Mutacija u RG57 |
Američko-1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Mutacija u RG57 |
Američko-1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Mutacija u RG57 i PEP |
Američko-1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Mutacija u RG57 |
Američko-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Izvorni genotip 2 |
Američko-6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Mutacija u PEP |
Američko-6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Mutacija u RG57 |
Američko-6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Mutacija u RG57 |
Američko-6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Mutacija u RG57 i PEP |
Američko-6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Mutacija u RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Izvorni genotip 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Mutacija u RG57 |
Također postoje promjene u spektrima izoenzima. U pravilu su uzrokovani razgradnjom organizma u početku heterozigotnog za ovaj enzim u homozigotni. 1993. godine na plodovima rajčice identificirali smo soj s karakteristikama karakterističnim za US-1: otisak prsta RG57, mitohondrijski DNK tip i 86/100 genotip za glukoza-6-fosfati-izomerazu, ali bio je homozigot (100/100) za prvi peptidazni lokus umjesto heterozigota 92/100 tipična za ovu klonsku liniju. Genotip ovog soja nazvali smo MO-17 (tablica 6). Mutantne linije US-1.1 i US-1.4 također se razlikuju od US-1 mutacijama na prvom lokusu peptidaze (tablica 7).
Mutacije koje dovode do promjena u broju gena virulencije za sorte krumpira i rajčice prilično su česte. Primijećeni su među izolatima klonske linije US-1 u populacijama iz Nizozemske (Drenth i sur., 1994.), Perua (Goodwin i sur., 1995.), Poljske (Sujkowski i sur., 1991.), sjeverne Sjeverne Amerike (Goodwin i sur., ., 1995b). Razlike u broju gena virulencije krumpira zabilježene su i među izolatima klonskih linija US-7 i US-8 u Kanadi i Sjedinjenim Državama (Goodwin i sur., 1995.), među izolatima linije SIB-1 u azijskom dijelu Rusije (Elansky i sur., 2001.) ).
Izolati s jakim razlikama u razinama rezistencije na fenilamidne lijekove identificirani su u populacijama monoklonskih polja, koje su sve pripadale klonskoj liniji Sib-1 (Elansky i sur, 2001., tablica 1). Gotovo svi sojevi klonske linije US-1 vrlo su osjetljivi na metalaksil, međutim, visoko otporni izolati te linije izolirani su na Filipinima (Koh i sur., 1994.) i u Irskoj (Goodwin i sur., 1996.).
Moderne populacije P. infestans
Srednja Amerika (Meksiko)
Populacija P. infestans u Meksiku značajno se razlikuje od ostalih svjetskih populacija, što je ponajprije posljedica njezinog povijesnog položaja. Brojna istraživanja ove populacije i srodnih vrsta P. infestans klade Phytophthora, kao i lokalnih vrsta roda Solanum, dovela su do zaključka da se evolucija patogena u središnjem dijelu Meksika dogodila zajedno s evolucijom biljaka domaćina i povezana sa spolnom rekombinacijom (Grünwald, Flier , 2005.). Obje vrste parenja zastupljene su u populaciji, i to u jednakim omjerima, a prisutnost oospora u tlu, na biljkama i gomoljima krumpira i divljim srodnim vrstama Solanum potvrđuje prisutnost spolnog procesa u populaciji (Fernández-Pavía i sur., 2002). Nedavna istraživanja doline Toluca i okoline (pretpostavljeno središte nastanka patogena) potvrdila su visoku genetsku raznolikost lokalne populacije P. infestans (134 multilokusna genotipa u uzorku od 176 uzoraka) i prisutnost nekoliko diferenciranih subpopulacija u regiji (Wang i sur., 2017.). Čimbenici koji pridonose ovoj diferencijaciji su prostorna podjela subpopulacija karakteristična za gorje središnjeg Meksika, razlike u uvjetima uzgoja i sortama krumpira koji se koriste u dolinama i planinama te prisutnost divljih gomoljastih vrsta Solanum koje mogu djelovati kao alternativni domaćini (Fry i sur. ., 2009).
Međutim, treba imati na umu da su populacije P. infestans u sjevernom Meksiku klonske prirode i sličnije su sjevernoameričkim populacijama, što može ukazivati na to da su to novi genotipovi (Fry i sur., 2009.).
Sjeverna Amerika
Sjevernoameričke populacije P. infestans uvijek su imale vrlo jednostavnu strukturu i njihov je klonski karakter uspostavljen mnogo prije upotrebe mikrosatelitske analize. Do 1987. godine klonska linija US-1 dominirala je u Sjedinjenim Državama i Kanadi (Goodwin i sur., 1995.). Sredinom 70-ih, kada su se pojavili fungicidi na bazi metalaksila, ovaj su klon počeli zamijeniti drugi, otporniji genotipovi koji su migrirali iz Meksika (Goodwin i sur., 1998.). Krajem 90-ih. genotip US-8 u potpunosti je zamijenio genotip US-1 u Sjedinjenim Državama i postao dominantna klonska linija na krumpiru (Fry i sur., 2009.; Fry i sur., 2015.). Situacija je bila drugačija s rajčicama, koje su stalno sadržavale nekoliko klonskih linija, a njihov se sastav mijenjao iz godine u godinu (Fry i sur., 2009.).
2009. godine u Sjedinjenim Državama izbila je velika epidemija kasne bolesti na rajčicama. Značajka ove pandemije bila je gotovo istodobna pojava na mnogim mjestima na sjeveroistoku SAD-a, a pokazalo se da je povezana s masovnom prodajom zaraženih sadnica rajčice u velikim vrtnim centrima (Fry i sur., 2013.). Gubici usjeva bili su ogromni. Mikrosatelitska analiza zahvaćenih uzoraka otkrila je da je soj pandemije pripadao tipu parenja klonske linije US-22 A2. 2009. udio ovog genotipa u američkoj populaciji P. infestans dosegao je 80% (Fry i sur., 2013). U sljedećim godinama udio agresivnih genotipova US-23 (uglavnom na rajčici) i US-24 (na krumpiru) neprestano se povećavao u populaciji, međutim, nakon 2011. godine, stopa otkrivanja US-24 značajno se smanjila i do danas je oko 90% populacije patogena u Sjedinjene Države predstavljaju genotip US-23 (Fry i sur., 2015.).
U Kanadi, kao i u Sjedinjenim Državama, krajem 90-ih. dominantni genotip US-1 istisnuo je US-8, čiji su dominantni položaji ostali nepromijenjeni do 2008. godine. U Kanadi su postojale ozbiljne epidemije kasne bolesti koje su povezane s prodajom zaraženih sadnica rajčice, ali uzrokovane su genotipovima US-2009 i US-2010 (Kalischuk i sur., 23.). Jasna geografska diferencijacija ovih genotipova bila je izvanredna: SAD-8 dominirali su zapadnim provincijama Kanade (2012%), dok su SAD-23 dominirali istočnim provincijama (68%). U sljedećim godinama SAD-8 se proširio na istočna područja, no općenito se njegov udio u populaciji blago smanjio u odnosu na pojavu genotipova US-83 i US-23 u zemlji (Peters i sur., 22.). Do danas, US-24 zadržava dominantan položaj u cijeloj Kanadi; US-2014 prisutan je u Britanskoj Kolumbiji, dok su US-23 i US-8 prisutni u Ontariju (Peters, 23.).
Dakle, sjevernoameričke populacije P. infestans uglavnom su klonske linije. Tijekom posljednjih 40 godina broj otkrivenih klonskih genotipova dosegao je 24. Unatoč činjenici da su u populaciji prisutni sojevi obje vrste parenja, vjerojatnost pojave novih genotipova kao rezultat spolne rekombinacije i dalje je prilično niska. Ipak, u posljednjih 20 godina zabilježeno je nekoliko slučajeva pojave efemernih rekombinantnih populacija (Gavino i sur., 2000.; Danies i sur., 2014.; Peters i sur., 2014.), a u jednom je slučaju rezultat križanja bio genotip US-11 , koja je bila ukorijenjena u Sjevernoj Americi dugi niz godina (Gavino i sur., 2000.). Do 2009. godine promjene u strukturi populacija bile su povezane s pojavom novih, agresivnijih genotipova s njihovim naknadnim migracijama i raseljavanjem prethodno dominantnih prethodnika. Što se dogodilo u 2009.-2010 u SAD-u i Kanadi epifitotici su prvi put pokazali da se u eri globalizacije izbijanje bolesti može povezati s aktivnim širenjem novih genotipova prilikom prodaje zaraženog sadnog materijala.
Južna Amerika
Do nedavno, istraživanja južnoameričkih populacija P. infestans nisu bila niti redovita, niti velika. Poznato je da je struktura ovih populacija prilično jednostavna i uključuje 1-5 klonskih loza po zemlji (Forbes i sur., 1998.). Dakle, do 1998. genotipovi US-1 (Brazil, Čile) BR-1 (Brazil, Bolivija, Urugvaj, Paragvaj), EC-1 (Ekvador, Kolumbija, Peru i Venezuela), AR-1, AR pronađeni su na krumpiru -2, AR-3, AR-4 i AR-5 (Argentina), PE-3 i PE-7 (južni Peru). Parenje tipa A2 bilo je prisutno u Brazilu, Boliviji i Argentini, a nije pronađeno izvan bolivijsko-peruanske granice na području jezera Titicaca, iza kojeg je dominirao genotip EC-1 A1 u Andama. Na rajčicama je US-1 ostao dominantan genotip u cijeloj Južnoj Americi.
Situacija se više-manje zadržala u 2000-ima. Važno je bilo otkriće nove klonske linije EC-2 tipa A2 na divljim srodnicima krumpira (S. brevifolium i S. tetrapetalum) u sjevernim Andama (Oliva i sur., 2010.). Filogenetske studije pokazale su da ova linija nije potpuno identična P. infestans, iako je s njom usko povezana, s tim u vezi predloženo je da se razmotri, kao i druga linija, EC-3, izolirana iz stabla rajčice S. betaceum koja raste u Andama, nova vrsta koja se zove P. andina; međutim, status ove vrste (neovisna vrsta ili hibrid P. infestans s nekom još uvijek nepoznatom linijom) još je uvijek nejasan (Delgado i sur., 2013.).
Trenutno su sve južnoameričke populacije P. infestans klonske. Unatoč prisutnosti obje vrste parenja, nisu identificirane rekombinantne populacije. Na rajčicama je genotip US-1 sveprisutan, očito je istisnut iz krumpira lokalnim sojevima, čije točno podrijetlo još uvijek nije poznato. U Brazilu, Boliviji i Urugvaju prisutan je genotip BR-1; u Peruu, uz US-1 i EC-1, postoji još nekoliko lokalnih genotipova. U Andama dominantan položaj zadržava klonska linija EC-1, čiji odnos s nedavno otkrivenom P. andinom ostaje nepoznat. Jedino "nestabilno" mjesto gdje je za razdoblje 2003.-2013. došlo je do značajnih promjena u populaciji, postao je Čile (Acuña i sur., 2012.), gdje je 2004.-2005. populaciju patogena karakterizira otpornost na metalaksil i novi haplotip mitohondrijske DNA (Ia umjesto prethodno prisutnog Ib). 2006. do 2011. godine U populaciji je dominirao genotip 21 (prema SSR-u) čiji je udio dosegao 90%, nakon čega je dlan prešao u genotip 20, čija se učestalost pojavljivanja u sljedeće dvije godine zadržala na oko 67% (Acuña, 2015).
Evropa
U povijesti Europe bila su najmanje dva vala migracije P. infestansa iz Sjeverne Amerike: u 1. stoljeću. (HERB-1) i početkom 70. stoljeća (US-1). Sveprisutna raspodjela fungicida koji sadrže metalaksil u XNUMX-ima. dovelo je do raseljavanja dominantnog genotipa US-XNUMX i njegove zamjene novim genotipovima. Kao rezultat toga, u većini zemalja zapadne Europe populacije patogena bile su zastupljene uglavnom s nekoliko klonskih linija.
Korištenje mikrosatelitske analize za analizu populacija patogena omogućilo je otkrivanje ozbiljnih promjena koje su se dogodile u zapadnoj Europi u razdoblju 2005.-2008. 2005. U Velikoj Britaniji je otkrivena nova klonska linija nazvana 13_A2 (ili "Plava 13") koju karakterizira tip parenja A2 , visoka agresivnost i otpornost na fenilamide (Shaw i sur., 2007.). Isti je genotip pronađen u uzorcima prikupljenim 2004. godine u Nizozemskoj i sjevernoj Francuskoj, što sugerira da je u Veliku Britaniju migrirao iz kontinentalne Europe, moguće sa sjemenskim krumpirom (Cooke i sur., 2007.). Proučavanje genoma predstavnika ove klonske linije pokazalo je visok stupanj polimorfizma njegove sekvence (do 2016. broj njegovih subklonalnih varijacija dosegnuo je 340) i značajan stupanj varijacije u razini ekspresije gena, uklj. efektorski geni tijekom biljne infekcije (Cooke i sur., 2012 .; Cooke, 2017.). Te bi značajke, zajedno s produženim trajanjem biotrofne faze, mogle uzrokovati povećanu agresivnost 13_A2 i njegovu sposobnost da zarazi čak i sorte krumpira otporne na kasnu plamenjaču.
U sljedećih nekoliko godina genotip se brzo širio zemljama sjeverozapadne Europe (Velika Britanija, Irska, Francuska, Belgija, Nizozemska, Njemačka) uz istodobno istiskivanje prethodno dominantnih genotipova 1_A1, 2_A1, 8_A1 (Montarry i sur., 2010; Gisi i sur. , 2011; Van den Bosch i sur., 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Prema internetskoj stranici www.euroblight.net, udio 13_A2 u stanovništvu tih zemalja dosegao je 60-80% i više; prisutnost ovog genotipa zabilježena je i u nekim zemljama istočne i južne Europe. Međutim, 2009.-2012. 13_A2 izgubio je svoje dominantne položaje u Velikoj Britaniji i Francuskoj, popuštajući liniji 6_A1 (8_A1 u Irskoj), a u Nizozemskoj i Belgiji djelomično je zamijenjen genotipovima 1_A1, 6_A1 i 33_A2 (Cooke i sur., 2012 .; Cooke, 2017.; Stellingwerf, 2017.).
Do danas je oko 70% zapadnoeuropske populacije P. infestans monoklonsko. Prema web mjestu www.euroblight.net, dominantni genotipovi u zemljama sjeverozapadne Europe (UK, Francuska,
Nizozemska, Belgija) ostaju, u približno jednakim omjerima, 13_A2 i 6_A1, potonji se praktički ne nalaze izvan navedene regije (s izuzetkom Irske), ali već imaju najmanje 58 subklona (Cooke, 2017). Varijacije 13_A2 prisutne su u primjetnom broju u Njemačkoj, a sporadično se primjećuju i u zemljama srednje i južne Europe. Genotip 1_A1 čini značajan dio populacija Belgije, dijelom Nizozemske i Francuske. Genotip 8_A1 stabilizirao se u europskoj populaciji na razini od 3-6%, s izuzetkom Irske, gdje zadržava vodeću poziciju i podijeljen je u dvije podklone (Stellingwerf, 2017.). Konačno, 2016. zabilježen je porast učestalosti pojave novih genotipova 36_A2 i 37_A2, prvi put zabilježen u 2013-2014; do danas se ti genotipovi nalaze u Nizozemskoj i Belgiji te dijelom u Francuskoj i Njemačkoj, kao i u južnom dijelu Velike Britanije (Cooke, 2017.). Otprilike 20-30% zapadnoeuropskog stanovništva svake godine predstavljaju jedinstveni genotipovi.
Za razliku od Zapadne Europe, do trenutka kada se pojavio genotip 13_A2, populacije Sjeverne Europe (Švedska, Norveška, Danska, Finska) nisu bile predstavljene klonskim linijama, već velikim brojem jedinstvenih genotipova (Brurberg i sur.,
2011.). Tijekom razdoblja aktivnog širenja 13_A2 u zapadnoj Europi, prisutnost ovog genotipa u Skandinaviji zabilježena je tek 2011. godine, kada je prvi put otkriven u Sjevernom Jutlandu (Danska), gdje se uglavnom uzgajaju industrijske sorte krumpira uz aktivnu uporabu metalaksila koji sadrži fungicidi (Nielsen i sur., 2014.). Prema www.euroblight.net, genotip 13_A2 također je otkriven u nekoliko uzoraka iz Norveške i Danske 2014. godine i u nekoliko norveških uzoraka 2016. godine; uz to je 2013. u Finskoj zabilježena prisutnost genotipa 6_A1 u maloj količini. Glavnim razlogom neuspjeha 13_A2 i drugih klonskih linija u osvajanju Skandinavije smatraju se klimatske razlike ove regije od zemalja zapadne Europe.
Uz činjenicu da prohladna ljeta i hladne zime doprinose preživljavanju oospora, a ne vegetativnog micelija (Sjöholm i sur., 2013.), smrzavanje tla zimi (što se obično ne događa u toplijim zemljama zapadne Europe) pridonosi sinkronizaciji klijanja i sadnje oospora. krumpir, što pojačava njihovu ulogu kao izvora primarne infekcije (Brurberg i sur., 2011.). Također treba napomenuti da, u sjevernim uvjetima, razvoj infekcije oosporama nadmašuje razvoj gomoljaste infekcije, što u konačnici sprječava dominaciju još agresivnijih, ali kasnije razvijenih klonskih linija (Yuen, 2012). Struktura najviše proučavanih populacija P. infestans u istočnoj Europi (Poljska, baltičke države) vrlo je slična onoj u Skandinaviji.
Ovdje su također prisutne obje vrste parenja, a velika većina genotipova utvrđenih SSR analizom jedinstvena je (Chmielarz i sur., 2014 .; Runno-Paurson i sur., 2016.). Kao i u sjevernoj Europi, širenje klonskih linija (prvenstveno genotipa 13_A2) praktički nije utjecalo na lokalne populacije patogena, koje zadržavaju visoku razinu raznolikosti uz odsutnost izraženih dominantnih linija.
Prisutnost 13_A2 povremeno se opaža na poljima s komercijalnim sortama krumpira. U Rusiji se situacija razvija na sličan način. Mikrosatelitska analiza izolata P. infestans prikupljenih 2008-2011 u 10 različitih regija europskog dijela Rusije, pokazao visok stupanj genotipske raznolikosti i potpuni nedostatak podudarnosti s europskim klonskim linijama (Statsyuk i sur., 2014.). Nekoliko godina kasnije, studija uzoraka P. infestans prikupljenih u Lenjingradskoj regiji u razdoblju 2013.-2014. Pokazala je značajne razlike između njih i genotipova iz ove regije utvrđenih u prethodnoj studiji. U obje studije nisu pronađeni zapadnoeuropski genotipovi (Beketova i sur., 2014 .; Kuznetsova i sur., 2016.).
Velika genetska raznolikost istočnoeuropskih populacija P. infestans i odsutnost dominantnih klonskih linija u njima mogu biti povezani iz nekoliko razloga. Prvo, kao i u sjevernoj Europi, klimatski uvjeti promatranih zemalja pridonose stvaranju oospora kao primarnog izvora zaraze (Ulanova i sur., 2010 .; Chmielarz i sur., 2014.). Drugo, značajan udio krumpira proizvedenog u tim zemljama uzgaja se na malim privatnim farmama, često okružen šumama ili drugim zaprekama slobodnom kretanju zaraznog materijala (Chmielarz i sur., 2014.). U pravilu se krumpir uzgajan u takvim uvjetima praktički ne tretira kemikalijama, a izbor sorti temelji se na njihovoj otpornosti na kasnu propadnost, t.j. ne postoji selektivni pritisak za agresivnost i otpornost na metalaksil, što rezistentnim genotipovima, poput 13_A2, oduzima prednosti u odnosu na druge genotipove (Chmielarz i sur., 2014.). Napokon, zbog male veličine zemljišnih parcela, njihovi vlasnici obično ne prakticiraju plodored, uzgajajući krumpir godinama na istome mjestu, što pridonosi nakupljanju genetski raznolikog inokuluma (Runno-Paurson i sur., 2016.; Elansky, 2015.; Elansky i sur. ., 2015).
Azija
Do nedavno je struktura populacija P. infestans u Aziji bila relativno slabo razumljiva. Znalo se da ga predstavljaju uglavnom klonske linije, a učinak spolne rekombinacije na pojavu novih genotipova vrlo je malen. Tako je, primjerice, 1997.-1998. U azijskom dijelu Rusije (Sibir i Daleki istok) populaciju patogena predstavljala su samo tri genotipa s prevlašću genotipa SIB-1 (Elansky i sur., 2001.). Prisutnost linija klonskih patogena pokazana je u zemljama kao što su Kina, Japan, Koreja, Filipini i Tajvan (Koh i sur., 1994.; Chen i sur., 2009.). Klonska linija US-1 dominirala je na velikom teritoriju Azije krajem 90-ih - početkom 2000-ih. gotovo su svugdje počeli biti zamijenjeni drugim genotipovima, koji su pak ustupili mjesto novim. U većini slučajeva promjene u strukturi i sastavu populacija u azijskim zemljama bile su povezane s migracijom novih genotipova izvana. Dakle, u Japanu, osim genotipa JP-3, svi drugi japanski genotipovi koji su se pojavili nakon US-1 (JP-1, JP-2, JP-3) imaju više ili manje dokazano vanjsko podrijetlo (Akino i sur., 2011) ... Trenutno u Kini postoje tri glavne populacije patogena, s jasnom zemljopisnom podjelom; Između ovih populacija ne postoji ili je vrlo slab protok gena (Guo i sur., 2010 .; Li i sur., 2013.b). Genotip 13_A2 pojavio se na teritoriju Kine u njezinim južnim provincijama (Yunnan i Sečuan) u razdoblju 2005.-2007., Te 2012.-1014. viđen je i na sjeveroistoku zemlje (Li i sur., 2013b). U Indiji se 13_A2 pojavio vjerojatno u isto vrijeme kad i u Kini, najvjerojatnije sa zaraženim sjemenskim krumpirom (Chowdappa i sur., 2015.), te 2009.-2010. izazvao je ozbiljnu epifitozu kasne plamenje na rajčici na jugu zemlje, nakon čega se proširio na krumpir i 2014. izazvao izbijanje kasne plamenje u zapadnom Bengalu, što je dovelo do propasti i samoubojstva mnogih lokalnih poljoprivrednika (Fry, 2016.).
Afrika
Do 2008.-2010 sustavna ispitivanja P. infestans u afričkim zemljama nisu provedena. Trenutno se afričke populacije P. infestans mogu podijeliti u dvije skupine, a ta je podjela jasno povezana s činjenicom da se sjemenski krumpir uvozi iz Europe.
U sjevernoj Africi, koja aktivno uvozi sjemenski krumpir iz Europe, tip parenja A2 široko je zastupljen u gotovo svim regijama, što pruža teoretsku mogućnost pojave novih genotipova kao rezultat spolne rekombinacije (Corbière i sur., 2010 .; Rekad i sur., 2017.). Uz to, u Alžiru se bilježi prisutnost genotipova 13_A2, 2_A1 i 23_A1 s izraženom dominacijom prvog od njih, kao i postupnim smanjenjem udjela jedinstvenih genotipova do potpunog nestanka (Rekad i sur., 2017.). Za razliku od ostatka regije, u Tunisu (s izuzetkom sjeveroistoka zemlje) populacija patogena zastupljena je uglavnom tipom parenja A1 (Harbaoui i sur., 2014.).
Ovdje dominira klonska linija NA-01. Općenito, udio klonskih linija u populaciji iznosi samo 43%. U istočnoj i južnoj Africi, gdje je količina uvoza sjemena nestajuće mala (Fry i sur., 2009.), P. infestans predstavljaju samo dvije klonske linije tipa A1, US-1 i KE-1, a druga aktivno istiskuje prvu na krumpiru ( Pule i sur., 2012 .; Njoroge i sur., 2016.). Do danas, oba ova genotipa imaju primjetan broj subklonskih varijacija.
Australija
Prvo izvješće o kasnoj bolesti na krumpiru u Australiji datira iz 1907. godine, a prva epifitotija, vjerojatno uzrokovana jakom kišom u ljetnim mjesecima, dogodila se 1909. - 1911. godine. (Drenth i sur., 2002). Općenito, međutim, kasna bolest nije značajna ekonomska važnost za zemlju. Sporadični napadi kasne bolesti, izazvani vremenskim uvjetima koji pružaju visoku vlažnost zraka, javljaju se ne više od jednom u 5-7 godina i uglavnom su lokalizirani na sjevernoj Tasmaniji i u središnjoj Viktoriji. S tim u vezi, publikacije posvećene proučavanju strukture australske populacije P. infestans praktički nedostaju. Posljednje dostupne informacije su od 1998. do 2000. godine. (Drenth i sur., 2002). Prema autorima, populacija Victorije bila je klonska linija US-1.3, što je neizravno potvrdilo migraciju ovog genotipa iz Sjedinjenih Država. Tasmanski uzorci klasificirani su kao AU-3, različito od genotipova koji su u to vrijeme bili prisutni u drugim dijelovima svijeta.
Značajke razvoja kasne bolesti u Rusiji
U Europi se kao primarni inokulum na krumpiru smatra infekcija unesena bolesnim sjemenskim gomoljima, oosporama koje su prezimile u tlu, kao i zoosporangijama koje je vjetar donio iz biljaka uzgojenih iz prezimljenih gomolja na prošlogodišnjim poljima (biljke "dobrovoljci") ili na gomilama oljuštenih krumpira. oznaka za skladištenje gomolja. Od toga se biljke uzgajane na gomilama odbačenih gomolja smatraju najopasnijim izvorom zaraze. tamo je broj proklijalih gomolja često značajan, a zoosporangije se iz njih mogu prenositi na velike udaljenosti. Ostali izvori (oospore, "dobrovoljne" biljke) nisu toliko opasni, jer nije običaj uzgajati biljke na istim poljima češće od jednom u 3-4 godine. Infekcija oboljelim gomoljima sjemena također je minimalna zbog dobrog sustava kontrole kvalitete sjemena.
Općenito, količina inokuluma u europskim populacijama je ograničena, pa je stoga porast epidemije prilično spor i može se uspješno kontrolirati kemijskim fungicidnim pripravcima. Glavni zadatak u europskim uvjetima je borba protiv infekcije u fazi kada započinje masovno širenje zoosporangije s pogođenih biljaka.
U Rusiji je situacija radikalno drugačija. Većina usjeva krumpira i rajčice uzgaja se u malim privatnim vrtovima; zaštitne mjere se na njima ili ne provode ili se fungicidni tretmani provode u nedovoljnom broju i započinju nakon pojave kasne mrlje na vrhovima. Kao rezultat toga, privatni povrtnjaci djeluju kao glavni izvor zaraze, iz koje se zoosporangia vjetrom prenosi na komercijalne zasade. To potvrđuju naša izravna opažanja u regijama Moskva, Brjansk, Kostroma, Rjazanj: oštećenja biljaka u privatnim vrtovima uočavaju se i prije početka fungicidnog tretmana komercijalnih zasada. Poslije toga, epidemija na velikim poljima suzbija se upotrebom fungicidnih pripravaka, dok se u privatnim vrtovima brzo razvija kasna bolest.
U slučaju nepravilnog ili "proračunskog" tretmana komercijalnih zasada, žarišta kasne bolesti također se pojavljuju na poljima; nakon toga se aktivno razvijaju, pokrivajući sve veća područja (Elansky, 2015). Infekcija u privatnim vrtovima ima značajan utjecaj na epidemije na komercijalnim poljima. U svim regijama uzgajanja krumpira u Rusiji površina koju zauzima krumpir u privatnim vrtovima nekoliko je puta veća od ukupne površine polja velikih proizvođača. U takvom okruženju privatni povrtnjaci mogu se promatrati kao globalni izvor inokuluma za komercijalna polja. Pokušajmo identificirati ona svojstva koja su karakteristična za genotipove sojeva u privatnim vrtovima.
Sadnja sjemena i karantenska kontrola konzumnog krumpira, sjemenki rajčice dobivenih od sumnjivih stranih proizvođača, dugotrajni uzgoj krumpira i rajčice na istim površinama, nepravilan tretman fungicidima ili njihovo potpuno odsustvo dovode do ozbiljnih epifitoza u privatnom sektoru, čiji je rezultat besplatan križanje, hibridizacija i stvaranje oospora u privatnim vrtovima. Kao rezultat toga, uočava se vrlo velika genotipska raznolikost patogena, kada je gotovo svaki soj jedinstven u svom genotipu (Elansky i sur., 2001., 2015.). Sadnjom sjemenskog krumpira različitog genetskog porijekla malo je vjerojatno da će se pojaviti klonske linije specijalizirane za napad na bilo koju sortu. Odabrani sojevi u takvom slučaju razlikuju se po svojoj svestranosti u odnosu na pogođene sorte, većina njih ima blizu maksimalnog broja gena virulencije. To se uvelike razlikuje od sustava "klonskih linija" tipičnog za velika polja poljoprivrednih poduzeća s pravilno instaliranim sustavom zaštite od kasne bolesti. "Klonske linije" (kada su svi sojevi uzročnika bolesti kasne bolesti u polju zastupljeni jednim ili više genotipova) sveprisutni su u zemljama u kojima se uzgoj krumpira obavlja isključivo na velikim farmama: SAD, Nizozemska, Danska itd. U Engleskoj, Irskoj, Poljskoj, gdje su parcele domaćinstava također tradicionalno raširene uzgoj krumpira, veća je i genotipska raznolikost u privatnim vrtovima. Krajem 20. stoljeća "klonske linije" bile su raširene u azijskim i dalekoistočnim dijelovima Rusije (Elansky i sur., 2001.), što je očito posljedica upotrebe istih vrsta krumpira isključivo za sadnju. Nedavno se situacija u tim regijama također počela mijenjati prema povećanju genotipske raznolikosti populacija.
Nedostatak intenzivnih tretmana fungicidnim pripravcima ima još jednu, izravnu posljedicu - u vrtovima nema nakupljanja rezistentnih sojeva. Doista, naši rezultati pokazuju da se sojevi otporni na metalaksil nalaze znatno rjeđe u privatnim vrtovima nego u komercijalnim zasadima.
Neposredna blizina zasada krumpira i rajčice, tipična za privatne vrtove, olakšava migraciju sojeva između ovih usjeva, što je rezultiralo time da je u posljednjem desetljeću među sojevima izoliranim od krumpira udio sojeva koji nose gen za rezistenciju na sorte cherry rajčice (T1), prethodno karakterističan samo za " rajčica "sojevi. Sojevi s genom T1 u većini su slučajeva vrlo agresivni prema krumpiru i rajčici.
Posljednjih godina kasna bolest na rajčici počela se pojavljivati u mnogim slučajevima ranije nego na krumpiru. Sadnice rajčice mogu biti zaražene oosporama u tlu ili oosporama prisutnim u sjemenkama rajčice ili prilijepljenim uz njih (Rubin i sur., 2001.). U posljednjih 15 godina u trgovinama se pojavio velik broj jeftinog pakiranog sjemena, uglavnom iz uvoza, a većina malih proizvođača prešla je na upotrebu. Sjeme može donijeti sojeve s genotipovima tipičnim za regije njihovog uzgoja. U budućnosti su ti genotipovi uključeni u spolni proces u privatnim vrtovima, što dovodi do pojave potpuno novih genotipova.
Stoga se može reći da su privatni vrtovi globalni "lonac za topljenje" u kojem se, kao rezultat razmjene genetskog materijala, obrađuju postojeći genotipovi i pojavljuju se potpuno novi. Štoviše, njihov se odabir odvija u uvjetima koji se vrlo razlikuju od onih stvorenih za krumpir na velikim farmama: odsutnost fungicidne preše, sortna jednolikost zasada, prevladavanje biljaka pogođenih različitim oblicima virusne i bakterijske infekcije, blizina rajčice i divljih noćnih sjena, aktivno križanje i stvaranje oospora, mogućnost kako bi oospore djelovale kao izvor zaraze sljedeće godine.
Sve to dovodi do vrlo visoke genotipske raznolikosti populacija dvorišta. U uvjetima epifitoze u povrtnjacima, kasna se bolest brzo širi i oslobađaju se ogromne količine spora, leteći do obližnjih komercijalnih zasada. Međutim, nakon što su u komercijalna polja ušli s ispravnim sustavom poljoprivredne tehnologije i kemijske zaštite, pristigle spore praktički nemaju priliku pokrenuti epifitotiku na terenu, što je zbog odsutnosti klonskih linija otpornih na fungicide i specijaliziranih za uzgajanu sortu.
Drugi izvor primarnog inokuluma mogu biti bolesni gomolji zarobljeni u komercijalne sadnice. Ti su se gomolji u pravilu uzgajali na poljima s dobrom poljoprivrednom tehnologijom i intenzivnom kemijskom zaštitom. Genotipovi izolata koji zaraze gomolje prilagođeni su razvoju vlastite sorte. Ovi sojevi su znatno opasniji za komercijalnu sadnju od inokuluma koji potječu iz privatnih vrtova. Rezultati naših studija također podupiru ovu pretpostavku. Populacije izolirane s velikih polja s pravilno provedenom kemijskom zaštitom i dobrom poljoprivrednom tehnologijom ne razlikuju se u velikoj genotipskoj raznolikosti. Često je to nekoliko klonskih linija koje su vrlo agresivne.
Sojevi komercijalnog sjemenskog materijala mogu ući u populacije u povrtnjacima i biti uključeni u procese koji se u njima odvijaju. Međutim, u povrtnjaku će njihova konkurentnost biti puno niža nego na komercijalnom polju, a uskoro će prestati postojati u obliku klonske linije, ali njihovi se geni mogu koristiti u populaciji "vrtova".
Infekcija koja se tijekom berbe razvije na biljkama "dobrovoljcima" i na gomilama izljuštenih gomolja nije toliko bitna za Rusiju, jer U glavnim regijama uzgajanja krumpira u Rusiji primjećuje se duboko zimsko smrzavanje tla, a biljke iz gomolja koje su prezimile u tlu rijetko se razvijaju. Štoviše, kao što pokazuju naši eksperimenti, uzročnik pojave kasne plamenje ne preživljava na negativnim temperaturama čak ni na gomoljima koji su zadržali svoju održivost. U sušnoj zoni, gdje se obavlja uzgoj ranog krumpira, kasna plamenjača prilično je rijetka zbog suhe i vruće sezone rasta.
Stoga trenutno promatramo podjelu populacija P. infestans na populacije „poljske“ i „vrtne“. Međutim, posljednjih godina uočeni su procesi koji vode do konvergencije i međusobnog prodiranja genotipova iz tih populacija.
Među njima se može primijetiti općenito povećanje pismenosti malih proizvođača, pojava pristupačnih malih pakiranja sjemenskog krumpira, širenje fungicidnih pripravaka u malim pakiranjima i gubitak straha od "kemije" stanovništva.
Situacije nastaju kada su, zahvaljujući snažnoj aktivnosti jednog dobavljača, cijela sela zasađena sjemenskim gomoljima iste sorte i opskrbljena malim pakiranjima istih pesticida. Može se pretpostaviti da će se krumpir iste sorte naći na komercijalnim zasadima u blizini.
S druge strane, neke tvrtke za trgovinu pesticidima promiču "proračunske" programe kemijske obrade. U ovom se slučaju podcjenjuje broj preporučenih postupaka i nude se najjeftiniji fungicidi, a naglasak nije na sprječavanju razvoja kasne bolesti do košenja vrhova, već na određenom kašnjenju epifitoze radi povećanja prinosa. Takve su sheme ekonomski opravdane kada se uzgaja krumpir od niskog stupnja sjemenskog materijala, kada u načelu ne dolazi u obzir postizanje visokog prinosa. Međutim, u ovom slučaju, za razliku od vrtnih populacija, izravnana genetska podloga krumpira pridonosi odabiru specifičnih fizioloških rasa koje su vrlo opasne za ovu sortu.
Općenito, tendencije ka približavanju "vrtnih" i "poljskih" metoda proizvodnje krumpira čine nam se prilično opasnima. Kako bi se spriječile njihove negativne posljedice, kako u kućnom, tako i u komercijalnom sektoru, bit će potrebno kontrolirati i sortiment sjemenskog krumpira i paletu fungicida koji se nude privatnim vlasnicima u maloj ambalaži, kao i praćenje shema zaštite krumpira i uporabu fungicidnih pripravaka u komercijalnom sektoru.
Na područjima privatnog sektora intenzivno se razvija ne samo kasna bolest, već i Alternaria. Većina vlasnika privatnih parcela ne poduzima posebne mjere za zaštitu od Alternarije, zamjenjujući razvoj Alternarije za prirodno uvenuće vrhova ili razvoj kasne bolesti. Stoga, s masovnim razvojem Alternarije na osjetljivim sortama, kućanske parcele mogu poslužiti kao izvor inokuluma za komercijalne sadnje.
Mehanizmi varijabilnosti
Proces mutacije
Budući da je pojava mutacija slučajan postupak koji se odvija s malom učestalošću, pojava mutacija na bilo kojem lokusu ovisi o učestalosti mutacije ovog lokusa i veličini populacije. Pri proučavanju učestalosti mutacija sojeva P. infestans obično se određuje broj kolonija uzgojenih na selektivnim hranjivim podlogama nakon obrade kemijskim ili fizičkim mutagenima. Kao što se može vidjeti iz podataka prikazanih u tablici 8, učestalost mutacije istog soja na različitim lokusima može se razlikovati za nekoliko redova veličine. Velika učestalost mutacija rezistencije na metalaksil može biti jedan od razloga akumulacije sojeva otpornih na njega u prirodi.
Učestalost spontanih ili induciranih mutacija, izračunata na temelju laboratorijskih pokusa, ne odgovara uvijek procesima koji se događaju u prirodnim populacijama iz sljedećih razloga:
1. Kod asinkronih nuklearnih fisija nemoguće je procijeniti učestalost mutacija po jednoj nuklearnoj generaciji. Stoga većina eksperimenata pruža informacije samo izravno o učestalosti mutacija, bez razlikovanja između dva mutacijska događaja i jednog događaja nakon mitoze.
2. Mutacije u jednom koraku obično smanjuju ravnotežu genoma, stoga se, zajedno s stjecanjem novog svojstva, smanjuje i opća sposobnost organizma. Većina eksperimentalno dobivenih mutacija ima smanjenu agresivnost i nisu zabilježene u prirodnim populacijama. Dakle, koeficijent korelacije između stupnja otpornosti mutanata P. infestans na fungicide fenilamida i brzine rasta u umjetnom okolišu bio je u prosjeku (-0,62), a otpornosti na fungicide i agresivnost na lišću krumpira (-0,65) (Derevyagina i sur. , 1993), što ukazuje na nisku sposobnost mutanata. Mutacije rezistencije na dimetomorf također su bile popraćene naglim smanjenjem vitalnosti (Bagirova i sur., 2001.).
3. Većina spontanih i induciranih mutacija recesivne su i ne pokazuju se fenotipski u pokusima, ali predstavljaju skrivenu rezervu varijabilnosti u prirodnim populacijama. Mutirani sojevi izolirani u laboratorijskim pokusima nose dominantne ili poludominantne mutacije (Kulish i Dyakov, 1979). Očigledno, nuklearna diploidija objašnjava neuspješne pokušaje dobivanja mutanata pod utjecajem UV zračenja koji su virulentni na prethodno otporne sorte (McKee, 1969). Prema autorovim izračunima, takve se mutacije mogu pojaviti s frekvencijom manjom od 1: 500000 XNUMX. Prijelaz recesivnih mutacija u homozigotno, fenotipski izraženo stanje može se dogoditi zbog spolne ili aseksualne rekombinacije (vidi dolje). Međutim, čak i u ovom slučaju, mutaciju mogu prikriti dominantni aleli jezgri divljeg tipa u cenotičnom (višedjeličnom) miceliju i fenotipski fiksirati samo tijekom stvaranja mononuklearnih zoospora.
Tablica 8. Učestalost mutacija P. infestans supstancama koje inhibiraju rast pod djelovanjem nitrosometiluree (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova i sur., 2001)
Veza | Učestalost mutacija |
Oksitetraciklin | 6,9 10 x-8 |
Blasticidin S | X 7,2 10-8 |
Streptomicin | 8,3 x10-8 |
Trihotecin | 1,8 10 x-8 |
Cikloheksimid | 2,1 10 x-8 |
Daaconil | <4 x 10-8 |
Dimethomorph | 6,3 10 x-7 |
Metalaxil | 6,9 10 x-6 |
Veličine populacije također igraju odlučujuću ulogu u nastanku spontanih mutacija. U vrlo velikim populacijama, u kojima je broj stanica N> 1 / a, gdje je a stopa mutacije, mutacija prestaje biti slučajna pojava (Kvitko, 1974).
Izračuni pokazuju da se s prosječnom najezdom polja krumpira (35 mjesta po biljci) dnevno na jednom hektaru stvori 8x1012 spora (Dyakov i Suprun, 1984). Izgleda da takve populacije sadrže sve mutacije dopuštene tipom razmjene na svakom lokusu. Čak će i rijetku mutaciju, koja se javlja s frekvencijom 10-9, tisuću jedinki od milijuna, koje žive na jednom hektaru polja krumpira, steći. Za mutacije koje se javljaju s većom učestalošću (na primjer, 10-6), u takvoj se populaciji mogu svakodnevno pojaviti razne uparene mutacije (istovremeno na dva lokusa), tj. postupak mutacije zamijenit će rekombinaciju.
Migracije
Za P. infestans poznate su dvije glavne vrste migracija: približavanje udaljenosti (unutar polja krumpira ili susjednih polja) širenjem zoosporangije zračnim strujama ili prskanjem kišom, te na velike udaljenosti - sadnjom gomolja ili prevezenim plodovima rajčice. Prva metoda osigurava širenje fokusa bolesti, druga - stvaranje novih žarišta na mjestima udaljenim od primarne.
Širenje infekcije gomoljima i voćem rajčice ne samo da pridonosi nastanku bolesti na novim mjestima, već je i glavni izvor genetske raznolikosti u populacijama. U Moskovskoj regiji uzgaja se krumpir koji se donosi iz različitih regija Rusije i zapadne Europe. Plodovi rajčice donose se iz južnih regija Rusije (Astrahanska oblast, Krasnodarski teritorij, Sjeverni Kavkaz). Sjeme rajčice, koje također može poslužiti kao izvor zaraze (Rubin i sur., 2001.), također se uvozi iz južnih regija Rusije, Kine, europskih zemalja i drugih zemalja.
Prema izračunima E. Mayr (1974), genetske promjene u lokalnoj populaciji uzrokovane mutacijama rijetko prelaze 10-5 po lokusu, dok u otvorenim populacijama razmjena zbog proticaja gena iznosi najmanje 10-3 - 10-4.
Migracija u zaraženim gomoljima odgovorna je za ulazak P. infestans u Europu, šireći se u sve regije svijeta u kojima se uzgaja krumpir; uzrokovali su najozbiljnije promjene stanovništva. Kasna bolest na krumpiru pojavila se na teritoriju Ruskog Carstva gotovo istodobno s njegovom pojavom u zapadnoj Europi.
Budući da je bolest prvi put zabilježena 1846.-1847. U baltičkim državama, a tek se sljedećih godina proširila u Bjelorusiji i sjeverozapadnim regijama Rusije, očito je njezino zapadnoeuropsko podrijetlo. Prvi izvor kasne bolesti u Starom svijetu nije toliko očit. Hipoteza koju su razvili Fry i suradnici (Fry i sur., 1992.; Fry, Goodwin, 1995., Goodwin i sur., 1994.) sugerira da je parazit prvo došao iz Meksika u Sjevernu Ameriku, gdje se proširio preko usjeva, a zatim je prevezen u zapadnu Europu (slika 7).
Kao rezultat ponovljenog zanošenja (dvostruki učinak "uskog grla"), pojedinačni su klonovi dospjeli u Europu čiji su potomci izazvali pandemiju na cijelom teritoriju Starog svijeta, gdje se uzgaja krumpir. Kao dokaz ove hipoteze autori navode, prvo, sveprisutnu pojavu samo jedne vrste parenja (A1) i, drugo, homogenost genotipova ispitivanih sojeva iz različitih regija (svi oni temelje se na molekularnim markerima, uključujući 2 izozimska lokusa, uzorke DNK uzimanja prstiju i struktura mitohondrijske DNA identična je i odgovara klonu US-1 opisanom u SAD-u). Međutim, neki podaci izazivaju sumnju barem u neke od odredbi navedene hipoteze. Analiza mitohondrijske DNA P. infestans izolirane iz herbarijskih uzoraka krumpira zaraženih tijekom prvog epifitotskog razdoblja 40-ih pokazala je da se oni razlikuju u strukturi mitohondrijske DNA iz klona US-1, koji je, prema tome, bio najmanje nije jedini izvor zaraze u Europi (Ristaino i sur., 2001.).
Situacija s kasnom bolešću ponovno se pogoršala 80-ih godina XX. Stoljeća. Dogodile su se sljedeće promjene:
1) Porasla je prosječna agresivnost populacije, što je posebno dovelo do široko rasprostranjenog najštetnijeg oblika kasne bolesti - oštećenja peteljki i stabljika.
2) Došlo je do pomaka u vremenu kasne mrlje na krumpiru - s kraja srpnja na početak srpnja, pa čak i na kraj lipnja.
3) Tip parenja A2, koji ranije nije bio u Starom svijetu, postao je sveprisutan.
Promjenama su prethodila dva događaja: masovna uporaba novog fungicida metalaksila (Schwinn i Staub, 1980) i pojava Meksika kao svjetskog izvoznika krumpira (Niederhauser, 1993). U skladu s tim, iznesena su dva razloga za promjenu populacije: pretvorba tipa parenja pod utjecajem metalaksila (Ko, 1994) i masovno unošenje novih sojeva s zaraženim gomoljima iz Meksika (Fry i Goodwin, 1995). Iako je međusobne pretvorbe tipova parenja pod utjecajem metalaksila dobio ne samo Ko, već i u radovima izvedenim u laboratoriju Moskovskog državnog sveučilišta (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), druga hipoteza je poželjnija. Zajedno s pojavom druge vrste parenja, dogodile su se ozbiljne promjene u genotipovima ruskih sojeva P. infestans, uključujući neutralne gene (izo enzim i RFLP lokusi), kao i u strukturi mitohondrijske DNA. Kompleks ovih promjena ne može se objasniti djelovanjem metalaksila, već je došlo do masovnog uvoza novih sojeva iz Meksika, koji su, budući da su bili agresivniji (Kato i sur., 1997.), istisnuli stare sojeve (US-1), postajući dominantni u populacijama. Promjena u sastavu europskog stanovništva dogodila se u vrlo kratkom vremenu - od 1980. do 1985. (Fry i sur., 1992.). Na teritoriju bivšeg SSSR-a pronađeni su „novi sojevi“ u zbirkama iz Estonije 1985. godine, odnosno ranije nego u Poljskoj i Njemačkoj (Goodwin i sur., 1994.). Posljednji put kada je "stari soj US-1" u Rusiji izoliran iz zaražene rajčice u Moskovskoj regiji 1993. godine (Dolgova i sur., 1997.). Također u Francuskoj, "stari" sojevi pronađeni su u zasadima rajčice sve do ranih 90-ih, odnosno nakon što su dugo nestali na krumpiru (Leberton i Andrivon, 1998). Promjene u sojevima P. infestans utjecale su na mnoge osobine, uključujući one od velike praktične važnosti, i povećale štetnost kasne plamenje.
Seksualna rekombinacija
Da bi spolna rekombinacija pridonijela varijabilnosti, potrebno je, prvo, prisutnost dvije vrste parenja u populaciji u omjeru bliskom 1: 1, i, drugo, prisutnost početne varijabilnosti populacije.
Odnos vrsta parenja uvelike varira u različitim populacijama, pa čak iu različitim godinama u jednoj populaciji (Tablica 9,10, 90). Razlozi tako drastičnih promjena u učestalosti tipova parenja u populacijama (kao, na primjer, u Rusiji ili u Izraelu početkom 2002-ih godina prošlog stoljeća) nisu poznati, ali vjeruje se da je to posljedica uvođenja konkurentnijih klonova (Cohen, XNUMX).
Neki neizravni podaci ukazuju na tijek spolnog procesa u određenim godinama i u određenim regijama:
1) Studije populacija iz moskovske regije pokazale su da je u 13 populacija u kojima je udio tipa parenja A2 manji od 10%, ukupna genetska raznolikost izračunata za tri lozima izozima 0,08, a u 14 populacija u kojima je udio A2 premašio 30%, genetska raznolikost bila je dvostruko veća (0,15) (Elansky i sur., 1999.). Dakle, što je veća vjerojatnost spolnog odnosa, to je veća genetska raznolikost populacije.
2) Odnos između omjera tipova parenja u populacijama i intenziteta stvaranja oospora primijećen je u Izraelu (Cohen i sur., 1997.) i u Nizozemskoj
(Flier i sur., 2004.). Naše studije pokazale su da su u populacijama u kojima su izolati s tipom parenja A2 činili 62, 17, 9 i 6%, oospore pronađene u 78, 50, 30 i 15% analiziranih listova krumpira (koji imaju 2 ili više mjesta).
Uzorci s 2 ili više mrlja znatno češće sadrže oospore od uzoraka s 1 pjegom (32, odnosno 14% uzoraka) (Apryshko i sur., 2004.).
Oospore su bile puno češće u lišću srednjeg i donjeg sloja biljke krumpira (Mytsa i sur., 2015.; Elansky i sur., 2016.).
3) U nekim su regijama otkriveni jedinstveni genotipovi čija je pojava povezana sa spolnom rekombinacijom. Dakle, u Poljskoj 1989. i Francuskoj 1990. sojevi homozigotni za glukozu-6-
fosfat izomeraza (GPI 90/90). Budući da su se prethodno tijekom 10 godina susretale samo 90/100 heterozigota, homozigotnost se pripisuje spolnoj rekombinaciji (Sujkowski i sur., 1994.). U Kolumbiji (SAD) izolati koji kombiniraju A2 s GPI 100/110 i A1 s GPI 100/100 česti su, međutim, na kraju sezone 1994. (16. kolovoza i 9. rujna), sojevi s rekombinantnim genotipovima (A1 GPI 100/110 i A2 GPI 100/100) (Miller i sur., 1997).
4) U nekim populacijama iz Poljske (Sujkowski i sur., 1994.) i Sjevernog Kavkaza (Amatkhanova i sur., 2004.), raspodjela DNK lokusa otisaka prstiju i alozimskih proteinskih lokusa odgovara distribuciji Hardy-Weinberga, što ukazuje
o visokom udjelu doprinosa spolne rekombinacije varijabilnosti populacija. U ostalim regijama Rusije nije pronađena podudarnost s distribucijom Hardy-Weinberga u populacijama, ali je pokazana prisutnost neravnoteže veza, što ukazuje na prevladavanje klonske reprodukcije (Elansky i sur., 1999.).
5) Genetska raznolikost (GST) između sojeva s različitim tipovima parenja (A1 i A2) bila je niža nego kod različitih populacija (Sujkowski i sur., 1994.), što neizravno ukazuje na spolne križanja.
Istodobno, doprinos seksualne rekombinacije raznolikosti stanovništva ne može biti vrlo velik. Ovaj je doprinos izračunat za populacije moskovske regije (Elansky i sur., 1999.). Prema izračunima Lewontina (1979) „rekombinacija, koja može proizvesti nove varijante iz dva lokusa s frekvencijom koja ne prelazi umnožak njihovih heterozigotnosti, postaje učinkovita samo ako su vrijednosti heterozigotnosti za oba alela već visoke“.
Uz omjer dvije vrste uparivanja, koji je tipičan za Moskovsku regiju, jednak 4: 1, frekvencija rekombinacije bit će 0,25. Vjerojatnost da će ukršteni sojevi biti heterozigotni za dva od tri proučavana lokusa izozima u proučavanim populacijama bila je 0,01 (2 soja od 177). Stoga vjerojatnost pojave dvostrukih heterozigota kao rezultat rekombinacije ne smije premašiti njihov produkt pomnožen s vjerojatnošću ukrštanja (0,25x0,02x0,02) = 10-4, tj. spolni rekombinanti obično ne spadaju u proučavani uzorak sojeva. Ti su izračuni rađeni za populacije iz moskovske regije koje karakterizira relativno velika varijabilnost. U monomorfnim populacijama poput sibirskih, spolni proces, čak i ako se događa u pojedinim populacijama, ne može utjecati na njihovu genetsku raznolikost.
Uz to, P. infestans karakterizira česta neusklađenost kromosoma u mejozi, što dovodi do aneuploidije (Carter i sur., 1999.). Takva kršenja smanjuju plodnost hibrida.
Paraseksualna rekombinacija, mitotska konverzija gena
U eksperimentima na fuziji sojeva P. infestans s mutacijama rezistencije na različite inhibitore rasta utvrđena je pojava mizolata rezistentnih na oba inhibitora (Shattock i Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). Sojevi otporni na dva inhibitora rasta nastali su kao rezultat heterokariotizacije micelija i u ovom su se slučaju cijepili tijekom razmnožavanja mononuklearnim zoosporama (Judelson, Ge Yang, 1998), ili nisu cjepili u potomstvu monozoospora, jer su imali tetraploidne (jer su početni izolati diploidni) jezgre (K , 1979). Heterozigotni diploidi razdvajali su se na vrlo niskoj frekvenciji zbog haploidizacije, nedisjunkcije kromosoma i mitotskog križanja (Poedinok i sur., 1982). Učestalost ovih procesa mogla bi se povećati uz pomoć određenih djelovanja na heterozigotne diploide (na primjer, UV zračenje klijavih spora).
Iako se stvaranje vegetativnih hibrida s dvostrukom rezistencijom događa ne samo in vitro, već i u gomoljima krumpira zaraženim smjesom mutanata (Kulish i sur., 1978), prilično je teško procijeniti ulogu paraseksualne rekombinacije u stvaranju novih genotipova u populacijama. Učestalost stvaranja segreganata uslijed haploidizacije, nedisjukcije kromosoma i mitotskog prelaska bez posebnih učinaka je zanemariva (manje od 10-3).
Pojava homozigotnih segregana heterozigotnih sojeva može se temeljiti i na mitotičkom križanju i na mitotičkoj konverziji gena, koja se kod P. sojae događa s frekvencijom od 3 x 10-2 do 5 x 10-5 po lokusu, ovisno o soju (Chamnanpunt i sur. , 2001.).
Iako se pokazalo da je učestalost pojave heterokariona i heterozigotnih diploida neočekivano velika (dosežući desetke posto), taj se postupak događa samo kad se spoje mutirane kulture dobivene iz istog soja. Kada se koriste različiti sojevi izolirani iz prirode, heterokariotizacija se ne događa (ili se događa s vrlo niskom učestalošću) zbog prisutnosti vegetativne nekompatibilnosti (Poedinok i Dyakov, 1981; Anikina i sur., 1997b; Cherepennikova-Anikina i sur., 2002). Slijedom toga, uloga paraseksualne rekombinacije može se svesti samo na intraklonalnu rekombinaciju u heterozigotnim jezgrama i prijelaz pojedinih gena u homozigotno stanje bez spolnog procesa. Ovaj postupak može biti od epidemiološkog značaja kod sojeva s recesivnim ili poludominantnim mutacijama rezistencije na fungicide. Njegov prijelaz u homozigotno stanje zbog paraseksualnog procesa povećat će otpor nosača mutacije (Dolgova, Dyakov, 1986).
Introgresija gena
Heterotalne vrste Phytophthora sposobne su za križanje s stvaranjem hibridnih oospora (vidi Vorob'eva i Gridnev, 1983; Sansome i sur., 1991; Veld i sur., 1998). Prirodni hibrid dviju vrsta Phytophthora bio je toliko agresivan da je ubio tisuće joha u Velikoj Britaniji (Brasier i sur., 1999.). P. infestans može se pojaviti s drugim vrstama roda (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum, itd.) Na uobičajenim biljkama domaćinu i u tlu, ali u literaturi je malo podataka o mogućnosti interspecifičnih hibrida. U laboratorijskim uvjetima dobiveni su hibridi između P. infestans i P. Mirabilis (Goodwin i Fry, 1994).
Tablica 9. Udio sojeva P. infestans s tipom parenja A2 u različitim zemljama svijeta u razdoblju od 1990. do 2000. (prema podacima otvorenih literarnih izvora i web stranicama www.euroblight.net, www.eucablight.org)
Zemlja | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Bjelorusija | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Belgija | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Ekvador | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Estonija | 8 (12) | ||||||||||
Engleska | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Finska | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Francuska | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Madžarska | 72 (32) | ||||||||||
Irska | 4 (145) | ||||||||||
Sjeverno. Irska | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Holandija | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Norveška | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Peru | 0 (34, 1984.-86.) | 0 (287, 1997.-98.) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Poljska | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Škotska | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Švedska | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Vels | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Koreja | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
Kina | 20 (142, 1995.-98.) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Kolumbija | 0 (40, 1994.-2000.) | ||||||||||
Urugvaj | 100 (25, 1998.-99.) | ||||||||||
Maroko | 60 (108, 1997.-2000.) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Сербия | 76 (37) | ||||||||||
Meksiko (Toluca) | 28 (292, 1988.-89.) | 50 (389, 1997.-98.) |
Tablica 10. Udio sojeva P. infestans s tipom parenja A2 u različitim zemljama svijeta u razdoblju od 2000. do 2011. godine
Zemlja | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Austrija | 65 (83) | ||||||||||
Bjelorusija | 42 (78) | ||||||||||
Belgija | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Švajcarska | 89 (19) | ||||||||||
Чехия | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Njemačka | 95 (53) | ||||||||||
Danska | 48 (52) | ||||||||||
Ekvador | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Estonija | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
Engleska | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Finska | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Francuska | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Madžarska | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Sjeverno. Irska | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Holandija | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Norveška | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Peru | 0 (36) | ||||||||||
Poljska | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Škotska | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Švedska | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Slovačka | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Vels | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Koreja | 46 (26) | ||||||||||
Brazil | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
Kina | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Vijetnam | 0 (294, 2003.-04.) | ||||||||||
Uganda | 0 (8) |
Dinamika genotipskog sastava populacija
Promjene u genotipskom sastavu populacija P. infestans mogu se dogoditi pod utjecajem migracije novih klonova iz drugih regija, poljoprivrednih praksi (promjena sorti, primjena fungicida) i vremenskih uvjeta. Vanjski utjecaji različito utječu na klonove u različitim fazama životnog ciklusa, stoga populacije godišnje doživljavaju cikličke promjene u frekvencijama gena koji su predmet selekcije, uslijed promjene u dominantnoj ulozi pomicanja i selekcije gena.
Utjecaj sorte
Nove sorte s učinkovitim genima za vertikalnu rezistenciju (R-geni) snažni su selektivni faktor koji odabire klonove s komplementarnim genima virulencije u populacijama P. infestans. U nedostatku nespecifične rezistencije u sorti krumpira, koja inhibira rast populacije patogena, proces promjene dominantnih klonova u populaciji događa se vrlo brzo. Dakle, nakon širenja sorte Domodedovsky u regiji Moskve, koja ima gen otpornosti R3, učestalost klonova virulentnih za ovu sortu porasla je s 0,2 na 0,82 u jednoj godini (Dyakov i Derevjagina, 2000).
Međutim, promjena učestalosti gena virulencije (patotipova) u populacijama događa se ne samo pod utjecajem uzgajanih sorti krumpira. Primjerice, u Bjelorusiji su do 1977. dominirali klonovi s genima virulencije 1 i 4, što je bilo uzrokovano uzgojem sorti krumpira s genima otpornosti R1 i R4 (Dorozhkin, Belskaya, 1979). Međutim, krajem 70-ih godina XX. Stoljeća pojavili su se klonovi s različitim genima virulencije i njihovim kombinacijama, a komplementarni geni otpora nikada se nisu koristili u uzgoju krumpira (ekstra virulencijski geni) (Ivanyuk i sur., 2002). Razlog za pojavu takvih klonova očito je posljedica migracije u Europu zaraznog materijala iz Meksika s gomoljima krumpira. Kod kuće su se ti klonovi razvili ne samo na kultiviranom krumpiru, već i na divljim vrstama koje nose razne gene otpora, pa je kombinacija mnogih gena virulencije u genom bila neophodna za preživljavanje u tim uvjetima.
Što se tiče sorti s nespecifičnom rezistencijom, one smanjenjem brzine razmnožavanja patogena usporavaju razvoj njegovih populacija, što je, kao što je već spomenuto, funkcija broja. Budući da je agresivnost poligena, klonovi koji sadrže veći broj gena za "agresivnost" akumuliraju se što prije što je veća populacija veća. Stoga visoko agresivne rase nisu proizvod prilagodbe uzgajanim sortama nespecifične rezistencije, već su, naprotiv, vjerojatnije da će se otkriti u zasadima vrlo osjetljivih sorti koje su akumulatori spora parazita.
Dakle, u Rusiji su najagresivnije populacije P. Infestana pronađene u zonama godišnjih epifitotija (populacije iz regija Sahalin, Lenjingrad i Bryansk). Ispostavilo se da je agresivnost ove populacije viša od one meksičke (Filippov i sur., 2004.).
Uz to, u listovima otpornih sorti stvara se manje oospora nego u osjetljivih (Hanson i Shattock, 1998), odnosno nespecifična rezistencija sorte također smanjuje sposobnosti rekombinacije parazita i mogućnost alternativnih načina zimovanja.
Utjecaj fungicida
Fungicidi ne samo da smanjuju broj fitopatogenih gljivica, tj. utječu na kvantitativne karakteristike njihovih populacija, ali također mogu mijenjati učestalost pojedinih genotipova, t.j. utjecati na kvalitativni sastav populacija. Među najvažnijim pokazateljima populacija koje se mijenjaju pod utjecajem fungicida su sljedeći: promjene otpornosti na fungicide, promjene agresivnosti i virulencije te promjene u reproduktivnim sustavima.
Utjecaj fungicida na otpornost i agresivnost populacija
Stupanj ovog utjecaja određuje, prije svega, vrsta uporabljenog fungicida, koji se uvjetno može podijeliti na polisit, oligosit i monosit.
Prvi uključuje većinu kontaktnih fungicida. Otpor prema njima (ako je to uopće moguće) kontrolira velik broj vrlo slabo ekspresivnih gena. Ova svojstva određuju odsutnost vidljivih promjena u rezistenciji stanovništva nakon tretmana fungicidima (iako je u nekim eksperimentima dobiveno određeno povećanje rezistencije). Populacija gljiva sačuvana nakon prskanja kontaktnim fungicidima sastoji se od dvije skupine sojeva:
1) Sojevi sačuvani u područjima biljaka koja nisu tretirana lijekom. Budući da nije bilo kontakta s fungicidom, agresivnost i otpornost ovih sojeva se ne mijenjaju.
2) Sojevi u dodiru s fungicidom čija je koncentracija na kontaktnim mjestima bila niža od smrtonosne. Kao što je gore spomenuto, rezistencija ovog dijela populacije također se ne mijenja, međutim, zbog djelomičnog štetnog učinka fungicida čak i u koncentraciji subletala na metabolizam gljivične stanice, opća sposobnost i njena parazitska komponenta, agresivnost, smanjenje (Derevyagina i Dyakov, 1990).
Dakle, čak i dio populacije koji nije umro, izložen kontaktu s fungicidom, ima slabu agresivnost i ne može biti izvor epifitotika. Stoga je pažljiv tretman koji smanjuje učestalost udjela populacije koja nije u kontaktu s fungicidom uvjet za uspjeh zaštitnih mjera. Otpornost na oligositne fungicide kontrolira nekoliko aditivnih gena.
Mutacija svakog gena dovodi do određenog povećanja rezistencije, a ukupni stupanj rezistencije posljedica je dodavanja takvih mutacija. Stoga se povećanje otpora događa u koracima. Primjer postepenog povećanja rezistencije su mutacije rezistencije na fungicid dimetomorf, koji se široko koristi za zaštitu krumpira od kasne bolesti. Otpornost na dimetomorf je poligenska i aditivna. Mutacija u jednom koraku blago povećava otpor.
Svaka sljedeća mutacija smanjuje ciljnu veličinu i, posljedično, učestalost sljedećih mutacija (Bagirova i sur., 2001.). Povećanje prosječne rezistencije populacije nakon višestrukog tretmana oligozitnim fungicidom događa se postupno i postupno. Stopu ovog postupka određuju najmanje tri čimbenika: učestalost mutacije gena rezistencije, koeficijent rezistencije (omjer smrtonosne doze rezistentnog soja u odnosu na osjetljivi) i učinak mutacija gena rezistencije na sposobnost.
Učestalost pojavljivanja svake sljedeće mutacije manja je od prethodne, stoga postupak ima prigušni karakter (Bagirova i sur., 2001.). Međutim, ako se u populaciji pojave procesi rekombinacije (seksualni ili paraseksualni), tada je moguće kombinirati različite mutacije roditelja u hibridnom soju i ubrzati proces. Stoga populacije panmixa stječu otpor brže od agamskih populacija, a kod potonjih populacije koje nemaju vegetativne barijere nekompatibilnosti brže od populacija odvojenih takvim barijerama. S tim u vezi, prisutnost sojeva u populacijama koji se razlikuju po vrstama parenja ubrzava proces stjecanja otpornosti na oligositne fungicide.
Drugi i treći čimbenik ne doprinose brzom nakupljanju sojeva otpornih na dimetomorf u populacijama. Svaka sljedeća mutacija približno udvostručuje otpor, koji je beznačajan, a istodobno smanjuje i brzinu rasta u umjetnom okruženju i agresivnost (Bagirova i sur., 2001.; Stem, Kirk, 2004.). Možda zato među prirodnim sojevima P. infestans praktički nema otpornih sojeva, čak ni onih prikupljenih iz zasada krumpira tretiranih dimetomorfom.
Populacija tretirana oligozitnim fungicidom sastojat će se i od dvije skupine sojeva: onih koji nisu bili u kontaktu s fungicidom, pa stoga nisu promijenili početne karakteristike (ako se u ovoj skupini nađu rezistentni sojevi, oni se neće akumulirati zbog veće agresivnosti i konkurentnosti osjetljivih sojeva), i sojevi u dodiru sa subletalnim koncentracijama fungicida. Među posljednjima je moguće nakupljanje otpornih sojeva, jer ovdje imaju prednosti u odnosu na osjetljive.
Stoga, kada se koriste oligositni fungicidi, nije važan toliko temeljit tretman, koliko visoka koncentracija lijeka, nekoliko puta veća od smrtonosne doze, jer je kod stupnjevite mutageneze početna rezistencija mutiranih sojeva mala.
Konačno, mutacije rezistencije na monositne fungicide vrlo su izražajne, odnosno jedna mutacija može zabilježiti visoku razinu rezistencije do potpunog gubitka osjetljivosti. Stoga se porast otpora populacija događa vrlo brzo.
Primjer takvih fungicida su fenilamidi, uključujući najčešći fungicid metalaksil. Mutacije rezistencije na njega javljaju se s velikom frekvencijom, a stupanj rezistencije kod mutanata vrlo je visok - faktor tisuću ili više premašuje osjetljivi soj (Derevyagina i sur., 1993). Iako se stopa rasta i agresivnost rezistentnih mutanata smanjuje u pozadini smrti osjetljivih sojeva od sistemskog fungicida, broj rezistentne populacije brzo raste, a paralelno s time raste i njegova agresivnost. Stoga, nakon nekoliko godina uporabe fungicida, agresivnost rezistentnih sojeva može ne samo izjednačiti agresivnost osjetljivih, već je i nadmašiti (Derevyagina i Dyakov, 1992.).
Utjecaj na seksualnu rekombinaciju
Budući da se česta pojava tipa parenja A2 u populacijama P. infestans podudarala s intenzivnom uporabom metalaksila protiv kasne propasti, pretpostavljalo se da metalaksil potiče konverziju tipa parenja. U P. parasitica eksperimentalno je dokazana takva pretvorba pod djelovanjem kloroneba i metalaksila (Ko, 1994). Jedan prolaz na mediju s niskom koncentracijom metalaksila doveo je do nastanka homotalnih izolata iz soja P. infestans osjetljivog na metalaksil s tipom parenja A1 (Savenkova i Cherepnikova-Anikina, 2002). Tijekom naknadnih prolaza na medijima s većom koncentracijom metalaksila, nije otkriven niti jedan izolat tipa uparivanja A2, međutim, većina izolata, kada su ukrštene s izolatima A2, umjesto oospora, stvorile su ružne nakupine micelija i bile su sterilne. Prolazi otpornog soja koji ima tip parenja A2 na medijima s visokom koncentracijom metalaksila omogućili su nam otkrivanje tri oblika promjena tipa parenja: 1) potpuna sterilnost kada se ukrsti s izolatima A1 i A2; 2) homotalizam (stvaranje oospora u monokulturi); 3) pretvorba tipa parenja A2 u A1. Dakle, metalaksil može uzrokovati promjene u vrstama parenja u populacijama P. infestans i, posljedično tome, seksualnu rekombinaciju u njima.
Učinci na vegetativnu rekombinaciju
Neki geni za rezistenciju na antibiotike povećali su učestalost hifalne heterokariotizacije i nuklearne diploidizacije (Poedinok i Dyakov, 1981). Kao što je ranije napomenuto, heterokariotizacija hifa tijekom fuzije različitih sojeva P. infestans događa se vrlo rijetko zbog fenomena vegetativne nekompatibilnosti kod ove gljive. Međutim, geni za rezistenciju na neke antibiotike mogu imati nuspojave, izražene u prevladavanju vegetativne nekompatibilnosti. To je svojstvo posjedovao 1S-1 mutirani gen za rezistenciju na streptomicin. Prisutnost takvih mutanata u poljskim populacijama fitoftore može povećati protok gena između sojeva i ubrzati prilagodbu cijele populacije novim sortama ili fungicidima.
Određeni fungicidi i antibiotici mogu utjecati na učestalost mitotičke rekombinacije, što također može promijeniti učestalost genotipa u populacijama. Široko korišteni fungicid benomil veže se na beta-tubulin, protein iz kojeg se grade mikrotubule citoskeleta, i time remeti procese odvajanja kromosoma u anafazi mitoze, povećavajući učestalost mitotske rekombinacije (Hastie, 1970).
Fungicid para-fluorofenilalanin, koji se koristi za liječenje nizozemske bolesti kod brijestova, ima isto svojstvo. Para-fluorofenilalanin povećao je učestalost rekombinacije u heterozigotnih diploida P. infestans (Poedinok i sur., 1982).
Cikličke promjene u genotipskom sastavu populacija u životnom ciklusu P. infestans
Klasični razvojni ciklus P. infestans u umjerenom pojasu sastoji se od 4 faze.
1) Faza eksponencijalnog rasta populacije (policiklična faza) s kratkim generacijama. Ova faza obično započinje u srpnju i traje 1,5-2 mjeseca.
2) Faza zaustavljanja rasta populacije uslijed naglog smanjenja udjela netaknutog tkiva ili nastupa nepovoljnih vremenskih prilika. Ova faza na farmama koja provode rano uklanjanje lišća prije berbe ispada iz godišnjeg ciklusa.
3) Faza zimovanja u gomoljima, popraćena značajnim smanjenjem broja populacije uslijed slučajne infekcije gomolja, usporenog razvoja infekcije u njima, odsutnosti ponovne zaraze gomolja, truljenja i odstrela zahvaćenih gomolja u normalnim uvjetima skladištenja.
4) Faza usporenog razvoja u tlu i na presadnicama (monociklična faza), u kojoj trajanje generacije može doseći mjesec dana ili više (kraj svibnja - početak srpnja). Obično je u to vrijeme bolesno lišće teško otkriti čak i uz posebna promatranja.
Faza eksponencijalnog rasta stanovništva (policiklična faza)
Brojna opažanja (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) pokazala su da na početku epifitota prevladavaju nisko virulentni i blago agresivni klonovi, koji se potom zamjenjuju virulentnijim i agresivnijim. stopa rasta agresivnosti populacije je veća što je sorta biljke domaćina manje otporna.
Kako populacija raste, povećava se koncentracija i selektivno važnih gena uvedenih u komercijalne sorte (R1-R4) i selektivno neutralnih (R5-R11). Dakle, u populacijama u blizini Moskve 1993. godine prosječna virulencija od kraja srpnja do sredine kolovoza povećala se s 8,2 na 9,4, a najveći porast primijećen je za selektivno neutralni gen virulencije R5 (s 31 na 86% virulentnih klonova) (Smirnov, 1996. ).
Smanjenje stope rasta stanovništva praćeno je smanjenjem parazitske aktivnosti stanovništva. Stoga su u depresivnim godinama ukupan broj rasa i udio vrlo virulentnih rasa niži nego u epifitoznih (Borisenok, 1969). Ako se na vrhuncu epifitoznih vremenskih uvjeta promijene u nepovoljne za kasnu zarazu i zaraza krumpirom smanji, koncentracija jako virulentnih i agresivnih klonova također se smanjuje (Rybakova i sur., 1987.).
Porast učestalosti gena koji utječu na virulenciju i agresivnost populacije može biti posljedica odabira virulentnijih i agresivnijih klonova u mješovitoj populaciji. Da bi se demonstrirao odabir, razvijena je metoda za analizu neutralnih mutacija koja je uspješno korištena u kemostatskim populacijama kvasca (Adams i sur., 1985.) i Fusarium graminearum (Wiebe i sur., 1995.).
Učestalost mutanata rezistentnih na blasticidin S u poljskoj populaciji P. infestans smanjivala se paralelno s rastom agresivnosti populacije, što ukazuje na promjenu dominantnih klonova tijekom rasta populacije (Rybakova i sur., 1987.).
Faza zimovanja u gomoljima
Tijekom zimovanja u gomoljima krumpira, virulencija i agresivnost sojeva P. infestans smanjuju se, a smanjenje virulencije događa se sporije od agresivnosti (Rybakova i Dyakov, 1990). Očito su, u uvjetima pogodnim za brzi rast veličine populacije (r-selekcija), korisni "ekstra" geni virulencije i velika agresivnost, stoga je razvoj epifitotika popraćen odabirom naj virulentnijih i najagresivnijih klonova. U uvjetima zasićenja okoliša, kada važnu ulogu nema brzina razmnožavanja, već trajanje postojanja u nepovoljnim uvjetima (K-selekcija), "ekstra" geni virulencije i agresivnosti smanjuju kondiciju, a klonovi s tim genima prvi izumiru, tako da prosječna agresivnost i virulencija stanovništva pada.
Faza vegetacije u tlu
Ova je faza najtajanstvenija u životnom ciklusu (Andrivon, 1995). Njegovo postojanje pretpostavlja se čisto spekulativno - zbog nedostatka informacija o tome što se događa s patogenom tijekom duljeg razdoblja (ponekad i više od mjesec dana) - od pojave sadnica krumpira do pojave prvih mjesta na njima. Na temelju promatranja i pokusa rekonstruirano je ponašanje gljive u ovom životnom razdoblju (Hirst i Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
Sporulacija gljive može se stvoriti na zaraženim gomoljima u tlu. Rezultirajuće spore klijaju s hifama, koje mogu dugo vegetirati u tlu. Primarne (nastale na gomoljima) i sekundarne (na miceliju u tlu) spore se kapilarnim strujama podižu na površinu tla, ali stječu sposobnost zaraze krumpira tek nakon što se njegovi donji listovi spuste i dođu u dodir s površinom tla. Takvi listovi (na njima se nalaze prva mjesta bolesti) ne nastaju odmah, već nakon dugotrajnog rasta i razvoja vrhova krumpira.
Dakle, u životnom ciklusu P. infestans, također može postojati i faza saprotrofne vegetacije. Ako je u parazitskoj fazi životnog ciklusa agresivnost najvažnija komponenta kondicije, onda je u saprotrofnoj fazi cilj smanjenja parazitskih svojstava, kao što je eksperimentalno pokazano za neke fitopatogene gljive (vidi Carson, 1993). Stoga bi se u ovoj fazi ciklusa agresivna svojstva trebala najintenzivnije izgubiti. Ali do sada nisu provedeni izravni eksperimenti koji bi potvrdili gornje pretpostavke.
Sezonske promjene utječu ne samo na patogena svojstva P. infestans, već i na otpornost na fungicide, koja raste u policikličkoj fazi (tijekom epifitotija), a smanjuje se tijekom zimovanja (Derevyagina i sur., 1991 .; Kadish i Cohen, 1992.). Posebno intenzivan pad otpornosti na metalaksil primijećen je između sadnje zahvaćenih gomolja i pojave prvih mjesta bolesti na terenu.
Intraspecifična specijalizacija i njezin razvoj
P. infestans uzrokuje epidemije u dvije komercijalno važne kulture, krumpiru i rajčici. Epifitotije na krumpiru započele su ubrzo nakon što je gljiva ušla u nova područja. Poraz rajčice primijećen je i nedugo nakon pojave infekcije na krumpiru, ali epifitozije na rajčici zabilježene su tek stotinu godina kasnije - sredinom XNUMX. stoljeća. Evo što Hallegli i Niederhauser pišu o porazu rajčice u SAD-u
(1962): „Otprilike 100 godina nakon teške epifitozije 1845. godine nije bilo malo ili gotovo nikakvih pokušaja dobivanja rezistentnih sorti rajčice. Iako je kasna plamenjača prvi put registrirana na rajčici već 1848. godine, nije postala predmetom ozbiljne pozornosti uzgajivača na ovoj biljci sve do jakog izbijanja bolesti 1946. godine. Na teritoriju Rusije kasna plamenjača rajčice registrirana je u 60. stoljeću. “Dugo vremena istraživači nisu obraćali pažnju na ovu bolest, jer nije prouzročila značajnu ekonomsku štetu. Ali 70-ih i 1979-ih. Epifitotije XX. Stoljeća kasne bolesti na rajčici primjećuju se u Sovjetskom Savezu, uglavnom u regiji Donje Volge, Ukrajini, Sjevernom Kavkazu, Moldaviji ... ”(Balashova, XNUMX).
Od tada je rajčica rajčica kasnom bolešću postala godišnja, proširila se na cijelom teritoriju industrijskog i kućnog uzgoja i nanosi ogromnu ekonomsku štetu ovoj kulturi. Što se dogodilo? Zašto se gotovo istovremeno pojavila prva pojava parazita na krumpiru i epifitozna lezija ove kulture i zašto je trebalo stoljeće da se epifitotik pojavi na rajčici? Te razlike podržavaju meksički, a ne južnoamerički izvor zaraze. Ako je vrsta Phytophthora infestans nastala kao parazit meksičkih gomoljastih vrsta roda Solanum, onda je razumljivo zašto je tako uzgajani kultivirani krumpir koji pripada istom dijelu roda kao i meksička vrsta, ali zbog odsustva koevolucije s parazitom, koji nije razvio mehanizme specifične i nespecifične rezistencije.
Rajčica pripada drugom odjeljku roda, vrsta njezine razmjene ima značajne razlike od gomoljaste vrste, stoga, unatoč činjenici da rajčica nije izvan prehrambene specijalizacije P. infestans, intenzitet njezina poraza bio je nedovoljan za ozbiljne ekonomske gubitke.
Pojava epifitozija na rajčici posljedica je ozbiljnih genetskih promjena u parazitu, koje su povećale njegovu sposobnost (patogenost) tijekom parazitizma. Vjerujemo da je novi oblik specijaliziran za parazitiranje rajčice rasa T1 koju je opisao M. Gallegly, a koja utječe na sorte cherry rajčice (Red Cherry, Ottawa), otpornu na rasu T0 raširenu na krumpiru (Gallegly, 1952). Očito, mutacija (ili niz mutacija) koja je pretvorila T0 utrku u T1 rasu i dovela do pojave klonova visoko prilagođenih porazu rajčice. Kao što se često događa, porast patogenosti za jednog domaćina popraćen je smanjenjem za drugog, odnosno nastala je početna, još uvijek ne potpuna intraspecifična specijalizacija - za krumpir (rasa T0) i rajčicu (rasa T1).
Koji su dokazi za ovu pretpostavku?
- Pojava na krumpiru i rajčici. Na lišću rajčice prevladava rasa T1, dok je na lišću krumpira rijetka. Prema S.F.Bagirovoj i T.A. Orešonkova (neobjavljeno) u Moskovskoj regiji 1991.-1992., Pojava T1 rase u zasadima krumpira bila je 0%, a u zasadima rajčice - 100%; u 1993. - 1995. - 33%, odnosno 90%; 2001. godine - 0% i 67%. Slični podaci dobiveni su u Izraelu (Cohen, 2002). Eksperimenti s infekcijom gomolja krumpira izolatima rase T1 i smjesom izolata T0 i T1 pokazali su da su izolati rase T1 slabo očuvani u gomoljima i da ih zamjenjuju izolati rase T0 (Dyakov i sur., 1975; Rybakova, 1988).
2) Dinamika trke T1 u zasadima rajčice. Primarnu infekciju lišća rajčice provode izolati rase T0, koji dominiraju u analizi infekcije na prvim mjestima formiranim na lišću. To potvrđuje općenito prihvaćenu shemu migracije parazita: Glavnu masu zaraze krumpirom stvara rasa T0, međutim, mali broj T1 klonova sačuvanih u krumpiru, jednom na rajčici, istiskuje rasu T0 i nakuplja se pred kraj epifitotskog razdoblja. Također je moguće da postoji alternativni izvor zaraze lišćem rajčice s rasom T1, koji nije tako moćan kao gomolji i lišće krumpira, ali je stalan. Stoga ovaj izvor slabo utječe na genetsku strukturu populacije koja zarazi rajčicu, ali naknadno određuje nakupljanje rase T1 (Rybakova, 1988; Dyakov i sur., 1994).
3) Agresivnost prema krumpiru i rajčici. Umjetna infekcija lišća rajčice i krumpira izolatima rasa T0 i T1 pokazala je da su prvi agresivniji za krumpir nego za rajčicu, a drugi agresivniji za rajčicu nego za krumpir. Te se razlike očituju u premještanju izolata ne-vlastite rase iz mješovite populacije tijekom prolaska na lišću u stakleniku (Dyakov i sur., 1975.) i na poljskim parcelama (Leberton i sur., 1999.); razlike u minimalnom zaraznom opterećenju, razdoblju latencije, veličini zaraznih mjesta i stvaranju spora (Rybakova, 1988 .; Dyakov i sur., 1994 .; Legard i sur., 1995 .; Forbes i sur., 1997 .; Oyarzun i sur., 1998 .; Leberton i sur. al., 1999 .; Vega-Sanchez i sur., 2000 .; Knapova, Gisi, 2002 .; Sussuna i sur., 2004).
Agresivnost izolata rase T1 na sorte rajčice kojima nedostaju geni otpora toliko je visoka da se ti izolati spore na lišću kao na hranjivom mediju, a da nekrotiziraju zaraženo tkivo (Dyakov i sur., 1975 .; Vega-Sanchez i sur., 2000.).
4) Virulencija za krumpir i rajčicu. T1 rasa utječe na sorte cherry rajčice s genom za otpornost Ph1, dok rasa T0 nije sposobna zaraziti ove sorte, t.j. ima užu virulenciju. U odnosu na diferencijatore
R-geni krumpira obrnuto su povezani, t.j. sojevi izolirani iz lišća rajčice manje su virulentni od sojeva "krumpira" (tablica 11).
5) Neutralni markeri. Analiza neutralnih biljega u populacijama P. infestans koji parazitiraju na krumpiru i rajčici također svjedoči o višesmjernoj intraspecifičnoj selekciji. U brazilskim populacijama P. infestans, izolati lišća rajčice pripadali su klonskoj liniji US-1, a oni iz lišća krumpira BR-1 (Suassuna i sur., 2004.). Na Floridi (SAD) od 1994. na krumpiru počinje dominirati klon US-90 (s pojavom većom od 8%), a klonovi US-11 i US-17 na rajčici, a potonji su izolati agresivniji za rajčicu nego za krumpir (Weingartner , Tombolato, 2004.). Značajne razlike u učestalosti genotipa (DNK otisci prstiju) u izolatima krumpira i rajčice utvrđene su za 1200 sojeva P. infestans prikupljenih u Sjedinjenim Državama od 1989. do 1995. (Deahl i sur., 1995.).
Korištenjem AFLP metode omogućeno je odvajanje 74 soja prikupljenih s lišća krumpira i rajčice u razdoblju 1996-1997. u Francuskoj i Švicarskoj, u 7 skupina. Sojevi krumpira i rajčice nisu se očito razišli, ali sojevi "krumpira" genetski su bili raznolikiji od onih "rajčica". Prvi su pronađeni u svih sedam klastera, a drugi samo u četiri, što ukazuje na specijaliziraniji genom drugog (Knapova i Gisi, 2002).
6) Mehanizmi izolacije. Ako se populacije parazita na dvije vrste biljaka domaćina razvijaju prema sužavanju specijalizacije na svog „vlastitog“ domaćina, tada se javljaju različiti pre- i postmejotični mehanizmi koji sprečavaju interpopulacijske genetske razmjene (Dyakov i Lekomtseva, 1984).
Nekoliko studija istraživalo je učinak izvora roditeljskih sojeva na učinkovitost hibridizacije. Prilikom križanja sojeva izoliranih iz različitih vrsta roda Solanum u Ekvadoru (Oliva i sur., 2002.), utvrđeno je da su sojevi s parenjem tipa A2 divljih solanaceae (klonska linija EC-2) najlošije ukršteni sa sojevima rajčice (linija EC -3), a najučinkovitije je ukršteno sa sojem krumpira (EC-1).
Utvrđeno je da svi hibridi nisu patogeni. Autori vjeruju da je nizak postotak hibridizacije i smanjenje patogenosti hibrida posljedica postmejotičkih mehanizama reproduktivne izolacije populacija.
U eksperimentima Bagirove i suradnika (1998.) velik je broj sojeva krumpira i rajčice ukršten sa svojstvima rasa T0 i T1. Najplodniji su bili ukrštaji sojeva T1xT1 izolirani iz rajčice (36 oospora u vidnom polju mikroskopa, 44% klijavosti oospora), a najmanje učinkoviti bili su ukrštanja rasa T0xT1 izolirani od različitih domaćina (mali broj razvijajućih i klijavih oospora, velik udio abortivnih i nerazvijenih oospora ... Učinkovitost križanja između izolata rase T0 izoliranih iz krumpira bila je srednja. Budući da glavnina sojeva rase T0 utječe na krumpir, on ima pouzdan izvor zimovanja - gomolje krumpira, uslijed čega je važnost oospora kao zimovalnih zaraznih jedinica za populacije krumpira mala. Prilagođeni "oblik rajčice" može prezimiti na rajčici u obliku oospora (vidi dolje) i stoga zadržava veću produktivnost spolnog procesa. Zbog visoke plodnosti, T1 stječe neovisni potencijal za primarnu infekciju u rajčici. Rezultati dobiveni od Knapove i suradnika (Knapova i sur., 2002.) mogu se tumačiti na isti način. Križevi sojeva izolirani od krumpira i sojevi rajčice dali su najveći broj oospora - 13,8 po kvadratnom mm. srednje (sa širenjem od 5-19) i srednjim postotkom klijavosti oospora (6,3 sa širenjem od 0-24). Ukrštanjem sojeva izoliranih iz rajčice dobiven je najmanji postotak oospora (7,6 s rasponom 4-12), a najveći postotak njihove klijavosti (10,8). Ukrštanjem sojeva izoliranih iz krumpira dobiven je srednji broj oospora (8,6 s velikim raspršivanjem podataka - 0-30) i najmanji postotak klijavosti oospora (2,7). Dakle, sojevi krumpira manje su plodni od onih rajčica, ali interpopulacijski križanje nije dao lošije rezultate od intrapopulacijskih. Moguće je da razlike s gornjim podacima Bagirove i sur. Objašnjavaju se činjenicom da su ruski istraživači radili sa sojevima izoliranim početkom 90-ih godina 90. stoljeća, a švicarski istraživači - sa sojevima izoliranim krajem XNUMX-ih.
Osnova za nisku plodnost može biti heteroploidija sojeva. Ako su u meksičkim populacijama, gdje su spolni proces i primarna infekcija potomstvom oospore redoviti, većina proučavanih sojeva P. Infestans diploidni, tada se u zemljama Starog svijeta uočava intrapopulacijski polimorfizam ploidije (di-, tri- i tetraploidni sojevi, kao i heterokariotski sojevi s heteroploidnim jezgrama) i sojevi koji imaju različite vrste parenja, tj. međusobno plodne, razlikuju se u nuklearnoj ploidiji (Therrien i sur., 1989., 1990 .; Whittaker i sur., 1992.; Ritch, Daggett, 1995.). Raznolikost jezgara u anteridijama i oogoniji može biti razlog niske plodnosti.
Što se tiče nuklearne razmjene između hifa tijekom anastomoza, to sprječava vegetativna nekompatibilnost, koja aseksualne populacije razbija na mnoge genetski izolirane klonove (Poedinok i Dyakov, 1987; Gorbunova i sur., 1989; Anikina i sur., 1997b).
7) Konvergencija populacija. Gornji podaci ukazuju da je moguća hibridizacija između sojeva P. infestans "krumpir" i "rajčica". Moguća je i uzajamna ponovna infekcija različitih domaćina, premda uz smanjenu agresivnost.
Istraživanje populacijskih markera u izolatima sa susjednih polja krumpira i rajčice 1993. godine pokazalo je da je oko četvrtine izolata izoliranih iz lišća rajčice premješteno sa susjednog polja krumpira (Dolgova i sur., 1997.). Teoretski, moglo bi se pretpostaviti da će se razilaženje populacija na dva domaćina povećati i dovesti do pojave specijaliziranih intraspecifičnih oblika (f.sp. krumpir i f.sp. rajčica), pogotovo jer oospore mogu postojati u biljnim ostacima (Drenth i sur., 1995 ; Bagirova, Dyakov, 1998) i sjemenke rajčice (Rubin i sur., 2001). Zbog toga rajčica trenutno ima izvor proljetne regeneracije neovisno o gomoljima krumpira.
Međutim, sve se dogodilo drugačije. Prezimljivanje oosporama omogućilo je parazitu da izbjegne najuži stadij u svom životnom ciklusu - monociklički stadij vegetacije u tlu, tijekom kojeg se smanjuju parazitska svojstva koja se ljeti postupno obnavljaju u policikličkoj fazi.
Tablica 11. Učestalost gena virulencije prema sortama diferencijatora krumpira u sojevima P. infestans
Zemlja | Godina | Prosječni broj gena virulencije u sojevima | Autor | |
od krumpira | od rajčice | |||
Francuska | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton i sur., 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998 | |
Francuska, Švicarska | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapova, Gisi, 2002. (monografija). |
Sjedinjene Države | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin i sur., 1995 |
SAD, Zap. Vašington | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance i sur., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Ekvador | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun i sur., 1998 |
Izrael | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Rusija, Mosk. regija | 1993 | 8.9 | 6.7 | Smirnov, 1996 |
Rusija, različite regije | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaja i drugi. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Primarne zoosporangije i zoospore, koje klijaju oospore, imaju visok stupanj parazitskog djelovanja, posebno ako su oospore nastale partenogenetski pod utjecajem feromona soja s suprotnom vrstom parenja. Stoga je zarazni materijal na sadnicama rajčice uzgojenim iz sjemena zaraženih oosporama visoko patogen i za rajčicu i za krumpir.
Te su promjene dovele do novog restrukturiranja stanovništva, izraženog u sljedećim važnim promjenama s epidemiološkog gledišta:
- Zaražene sadnice rajčice postale su važan izvor primarne zaraze krumpira (Filippov, Ivanyuk, osobne poruke).
- Epifitozije na krumpiru počele su se promatrati već u lipnju, otprilike mjesec dana ranije nego inače.
- U zasadima krumpira povećao se postotak rase T1, koji je tamo prethodno pronađen u neznatnoj količini (Ulanova i sur., 2003).
- Sojevi izolirani iz lišća rajčice više se nisu razlikovali od sojeva krumpira po virulenciji na diferencijatorima gena virulencije krumpira i počeli su nadmašivati sojeve "krumpira" agresivnošću ne samo na rajčici, već i na krumpiru (Lavrova i sur., 2003; Ulanova i sur. , 2003).
Dakle, umjesto razilaženja, došlo je do zbližavanja populacija, pojave jedne populacije na dvije biljke domaćina s velikom virulencijom i agresivnošću na obje vrste.
Zaključak
Dakle, unatoč više od 150 godina intenzivnog proučavanja P. infestans, u biologiji, uključujući populacijsku biologiju ovog uzročnika najvažnijih bolesti uzgajanih solanaceous biljaka, mnogo toga ostaje nepoznato. Nije jasno kako prolazak pojedinih faza životnog ciklusa utječe na strukturu populacija, koji su genetski mehanizmi kanalizirane varijabilnosti agresivnosti i virulencije, koliki je omjer reproduktivnog i klonskog sustava razmnožavanja u prirodnim populacijama, kako se nasljeđuje vegetativna nekompatibilnost, kakva je uloga krumpira i rajčice u primarnoj zarazi ovih usjeva i u kakav je njihov utjecaj na strukturu populacije parazita. Do sada nisu riješena tako važna praktična pitanja kao što su genetski mehanizmi za promjenu agresivnosti parazita ili erozija nespecifične rezistencije krumpira. Produbljivanjem i širenjem istraživanja na kasnoj plamenjači krumpira, parazit postavlja nove izazove istraživačima. Međutim, poboljšanje eksperimentalnih sposobnosti, pojava novih metodoloških pristupa manipulaciji genima i proteinima omogućuju nam da se nadamo uspješnom rješenju postavljenih pitanja.
Članak je objavljen u časopisu "Zaštita krumpira" (br. 3, 2017)