JESTI. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Aleksandrova, S.N. Elanski
Nedavno se pokazalo da je gljiva askomiceta Ilyonectria crassa sposobna zaraziti gomolje krumpira. Ovaj je rad prvi koji analizira biološke karakteristike i otpornost na neke fungicide soja I. crassa izoliranog iz krumpira. Sljedovi vrsta specifičnih regija soja "krumpir" podudarali su se s onima dobivenim ranije za gljive izolirane iz korijena narcisa, ginsenga, jasike i bukve, lukovica ljiljana i lišća tulipana. Čini se da mnoge samonikle i vrtne biljke mogu biti rezervati I. crassa. Istraženi soj zaražio je kriške rajčice i krumpira, ali nije zarazio cijelo voće rajčice i netaknuti gomolj krumpira. To pokazuje da je I. crassa ranjeni parazit. Procjena rezistencije na fludioksonil, difenokonazol i azoksistrobin na hranjivom mediju pokazala je visoku učinkovitost ovih lijekova.
Pokazatelj EC50 (koncentracija fungicida, koja usporava dvostruku brzinu radijalnog rasta kolonije u odnosu na nefungicidnu kontrolu) bio je jednak 2; 0.4, odnosno 7.4 mg / l. Pri fitopatološkoj procjeni gomolja krumpira i razvoju mjera zaštite bilja treba uzeti u obzir mogućnost razvoja bolesti uzrokovane I. crassa.
Razvoj fitopatogenih mikroorganizama dovodi do velikih gubitaka u svim fazama uzgoja i skladištenja krumpira. Pri planiranju zaštitnih mjera, u pravilu se uzimaju u obzir dobro poznati patogeni, poput vrsta rodova Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora itd. Međutim, posljednjih godina pojavljuje se sve više izvještaja o pojavi novih fitopatogenih mikroorganizama na krumpiru. Njihova je biologija slabo proučena, učinkovitost fungicida korištenih na krumpiru u odnosu na njih je nepoznata, dijagnostičke metode nisu razvijene. Masovnim razvojem sposobni su nanijeti značajnu štetu usjevu krumpira. Jedan od tih mikroorganizama je gljiva askomiceta Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, koju su prvi otkrili autori na gomoljima krumpira (Chudinova i sur., 2019.).
Ovaj rad predstavlja rezultate analize soja I. crassa izoliranog iz gomolja krumpira. Proučavana je morfologija kolonija i micelijskih struktura I. crassa, nukleotidne sekvence DNA specifičnih regija, virulencija prema krumpiru i rajčici te otpornost na neke popularne fungicide.
Materijali i metode
Koristili smo soj I. crassa 18KSuPT2 izoliran 2018. godine iz zaraženog gomolja krumpira uzgojenog u regiji Kostroma. Na gomolj je utjecao tip suhe truleži sa šupljinom prekrivenom svijetlosmeđim micelijem. Pomoću sterilne igle za seciranje gljivični micelij prebačen je u Petrijevu zdjelicu s agar medijem (sladovina 10%, agar 1.5%, penicilin 1000 U / ml). Ploče su inkubirane u mraku na 24 ° C.
Za fotografiranje, procjenu veličine i morfologije spora i spora spora korišteni su svjetlosni mikroskop Leica DM2500 s digitalnim fotoaparatom ICC50 HD i binokularni mikroskop Leica M80 s digitalnim fotoaparatom IC80HD (Leica Microsystems, Njemačka).
Da bi se izolirao DNA, gljivični micelij uzgajan je u tekućem mediju graška, zatim zamrznut u tekućem dušiku, homogeniziran, inkubiran u CTAB puferu, pročišćen kloroformom i ispran dva puta sa 2% alkohola.
Metoda ekstrakcije DNA detaljno je opisana u članku Kutuzove i sur. (2017.).
Da bi se molekularnim metodama odredila vrsta i uspoređivala s drugim poznatim sojevima I. crassa, PCR je proveden s početnicima koji su omogućili amplifikaciju specifičnih za regiju DNA regija: ITS1-5,8S-ITS2 (početnici ITS5 / ITS4, White i sur., 1990), genska područja -tubulin (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) i faktor rastezanja translacije 1α (tef1α) (početnici EF1-728F / EF1-986R, Carbone i Kohn, 1999). Amplikoni željene duljine ekstrahirani su iz gela pomoću Evrogen CleanUp kompleta. Pojačane regije sekvencirane su pomoću BigDye® Terminator v3.1 kompleta za sekvenciranje ciklusa (Applied Biosystems, CA, USA) na automatiziranom sekvenceru Applied Biosystems 3730 xl (Applied Biosystems, CA, USA). Rezultirajuće nukleotidne sekvence korištene su za traženje podudaranja u bazi podataka GenBank američkog Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI). Filogenetska analiza provedena je pomoću programa MEGA 6 (Tamura i sur., 2013).
Određivanje virulencije provedeno je na cjelovitim zelenim plodovima krupnoplodne rajčice (sorta Dubrava) i gomoljima krumpira (sorta Gala). Uz to, za simulaciju oštećenja oštećenih plodova i gomolja koristili smo kriške istog voća i gomolja. Kriške gomolja stavljale su se u vlažne komore, koje su bile Petrijeve posude s mokrim filtarskim papirom na dnu. Na papir se stavljao dijapozitiv, na koji su se, pak, stavljale kriške gomolja ili voća. Cijeli gomolji i voće također su smješteni u posude s mokrim filtarskim papirom na dnu. U središte kriške (ili na netaknutu površinu gomolja ili ploda) stavljen je komadić agara (5 × 5 mm) s gljivičnim hifama nakon 5 dana uzgoja na agaru sladovine.
Procjena otpornosti sojeva gljivica na fungicide provedena je u laboratorijskim uvjetima na hranjivom mediju agar. Proučavali smo osjetljivost na fungicidne lijekove Maxim, KS (aktivni sastojak fludioksonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoksistrobin 250 g / l), Scor, EC (difenokonazol 250 g / l) (Državni katalog ..., 2020). Evaluacija je provedena u Petrijevim zdjelicama na sladovinarskom mediju s dodatkom ispitivanih lijekova u koncentraciji djelatne tvari 0.1; jedan; 1 ppm (mg / L) (za fludioksonil i difenokonazol), 10; deset; 1 ppm (za azoksistrobin) i u mediju bez fungicida (kontrola). Fungicid je dodan u rastopljeni i ohlađen medij od 10 ° C, nakon čega je medij uliven u Petrijeve zdjelice. Blok agara s gljivičnim micelijem stavljen je u središte Petrijeve zdjelice i uzgajan na temperaturi od 100 ° C u mraku. Nakon 60 dana inkubacije, promjeri kolonija izmjereni su u dva međusobno okomita smjera; prosječni su rezultati mjerenja za svaku koloniju. Pokusi su izvedeni u tri primjerka. Na temelju rezultata analiza izračunat je EC24, jednak koncentraciji fungicida, što je prepolovilo brzinu radijalnog rasta kolonije u odnosu na fungicidnu kontrolu.
Rezultati i rasprava
Na Petrijevim zdjelicama s agatom od sladovine gljiva je stvorila kolonije s bijelim flokulentnim micelijem. Podloga ispod micelija postala je crveno-smeđa. Kad se medij osuši, gljiva je na malim i spojenim konidioforima u malim sporodohijama stvorila spore dvije vrste. Makrokonidiji su izduženi, cilindrični, s jednom do tri pregrade, prosječne duljine 27.2 µm s rasponom vrijednosti od 23.2 do 32.2 µm, širine - do 4.9 µm (slika 1). Prosječna duljina mikrokonidija je 14.3 µm s rasponom vrijednosti od 10.3 do 18.1 µm, širina je do 4.0 µm. Svi makro- i mikromorfološki znakovi uklapaju se u raspon varijacija vrste Ilyonectria crassa (Cabral i sur., 2012.).
Sljedovi specifičnih za regiju DNA regija (ITS, b-tubulin, TEF 1α) u potpunosti su se podudarali sa sekvencama sojeva I. crassa koje smo ranije proučavali (Chudinova i sur., 2019, tablica 1). Kako bi se proučila prevalencija I. crassa u drugim regijama i analizirao spektar zahvaćenih kultura, analizirane su slične DNA sekvence u bazi podataka GenBank (Tablica 1). Preklapanje je bilo 86 do 100%. Sljedovi sve tri DNA regije soja I. krupe "krumpir" identični su sekvencama sojeva izoliranih iz lukovice ljiljana i korijena narcisa u Nizozemskoj i iz korijena ginsenga u Kanadi. Nismo uspjeli pronaći druge sojeve I. crassa s tri analizirane slične sekvence u otvorenim bazama podataka. Međutim, analiza taloženih ITS i b-tubulinskih sekvenci pokazala je prisutnost I. crassa na lišću tulipana u Velikoj Britaniji. Gljive sa sličnim ITS redoslijedom identificirane su u analizi mikobiote korijena jasike u Kanadi i korijena bukve u Italiji, gomolja krumpira u Saudijskoj Arabiji (tablica 1). Rezultati ovog istraživanja pokazuju da je I. crassa globalno rasprostranjena i sposobna zaraziti razne biljne vrste.
Pri utvrđivanju patogenosti na kriškama rajčice i krumpira 5. dana, promjer lezije dosegao je 1.5 cm. Istraženi soj nije zarazio cijelo voće rajčice i netaknuti gomolj krumpira. Međutim, na paradajzu su zahvaćene čajne čašice. Da bi se isključila mogućnost kontaminacije, gljivični izolat iz micelija razvijenog na kriški gomolja krumpira izoliran je u čistu kulturu. Bio je potpuno identičan roditeljskom soju. Izgleda da je I. crassa ranjeni parazit.
Tretiranje sjemenskih gomolja fungicidima prije sadnje smanjuje razvoj bolesti na biljkama tijekom vegetacije. Za odabir učinkovitih fungicida važno je procijeniti koji su od njih učinkoviti protiv I. srasse. U radu su proučene široko rasprostranjene aktivne tvari fungicida - fludioksonil, azoksistrobin, difenokonazol. Fludioxonil je uključen u nekoliko mješavina koje se koriste za obradu sjemena i sjemenskih gomolja prije sadnje. Fludioxonil (Maxim) također se koristi za liječenje gomolja sjemena prije skladištenja. Difenokonazol i azoksistrobin također su uključeni u brojne pripravke koji se koriste za preradu sjemenskog materijala, kao i u pripravke namijenjene preradi vegetativnog bilja (Državni katalog ..., 2020).
Stupanj rasta I. crassa proučavan je na podlogama (slika 2) s različitim koncentracijama aktivnih tvari: fludioksonil (EC50 = 0.4 ppm), azoksistrobin (EC50 = 4 ppm) i difenokonazol (EC50 = 7.4 ppm) (tablica 2). Ovi se pripravci mogu smatrati visoko učinkovitima protiv I. crassa, jer je njihov EC50 znatno niži od preporučene koncentracije pripravka u radnoj tekućini koja se koristi za tretiranje gomolja. Prema Državnom katalogu ... (2020.), koncentracija fludioksonila u tekućini za obradu gomolja krumpira iznosi od 500 do 1000 ppm, azoksistrobina (u tekućini za obradu dna brazde) - 3750-9375 ppm, difenokonazola (u tekućini za tretiranje vegetativnih biljaka) - 187.5– 625 ppm.
Tablica 1. Sličnost slijed vrsta specifičnih sekvenci sojeva 18KSuPT2 i sojeva Ilyonectria crassa dostupnih u bazi podataka Genbank
naprezanje | Biljka domaćin, mjesto izlučivanja | Brojevi sekvenci položeni u GenBank, postotak sličnosti | Link | ||
ITS | β-tubulin | TEF 1α | |||
17KSPT1 i 18KSuPT2 | Gomolj krumpira, regija Kostroma | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova i sur., 2019, ovo djelo |
DZS 158/31 | Korijeni narcisa, Nizozemska | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral i sur., 2012 |
DZS 139/30 | Lukovica ljiljana, Nizozemska | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Korijen ginsenga, Kanada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | List tulipana, Velika Britanija | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014. (enciklopedijska natuknica) |
MT294410 | Korijeni Aspen, Kanada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield i sur., 2020 |
ER1937 | Bukva, Italija | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Izravno podnošenje |
KAUF19 | Gomolj krumpira, Saudijska Arabija | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = nije deponirano
Tablica 2. Otpornost Ilyonectria crassa na fungicide
(aktivna tvar) | EC50, ppm | ||||
3 dan | 5 dan | 7 dan | |||
Kontrola | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoksistrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioksonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (difenokonazol) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
U našem radu sojevi I. crassa izolirani su iz gomolja krumpira u regijama Kostroma i Moskva (Chudinova i sur., 2019.). Visok udio sojeva gljiva s ITS sekvencama identičnim I. crassa otkriven je prilikom analize mikobiote gomolja krumpira u Saudijskoj Arabiji (Gashgari i Gherbawy, 2013). Čini se da I. crassa nije tako rijetka na krumpiru kako bi se moglo činiti. Naši su eksperimenti pokazali da gljiva može zaraziti oštećene plodove rajčice. Iz literature je poznato da je I. crassa sposobna saprotrofno se razvijati u tlu (Moll i sur., 2016.), kao i da utječe na razne biljke, čak i taksonomski udaljene poput narcisa, ljiljana, ginsenga, jasike i bukve (tablica 1). jedan). Izgleda da mnoge samonikle i vrtne biljke mogu biti rezervat I. crassa. Navedeno pokazuje da je prilikom razvijanja mjera zaštite potrebno uzeti u obzir mogućnost utjecaja na gomolje krumpira ovom gljivom. Rašireni pripravci za liječenje gomolja krumpira koji sadrže fludioksonil, azoksistrobin i difenokonazol pokazali su visoku fungicidnu učinkovitost protiv I. crassa.
Ovaj je rad podržala Ruska zaklada za temeljna istraživanja (grant br. 20-016-00139).
Članak je objavljen u časopisu "Bilten o zaštiti bilja", 2020, 103 (3)