D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Fitopatogena gljiva Colletotrichum coccodes uzrokuje opasne bolesti u krumpiru i rajčici poznate kao antraknoza i crna pjegavost gomolja. Po morfološkim karakteristikama često ih je teško razlikovati od bolesti uzrokovanih drugim mikroorganizmima; na plodovima zelene rajčice bolest može biti asimptomatska, manifestirajući se samo na zrelim crvenim plodovima. Za brzu i preciznu dijagnozu patogena nudi se PCR testni sustav u stvarnom vremenu. Da bi se razvio testni sustav, određena je nukleotidna sekvenca gena glicerol trifosfat dehidrogenaze od 45 C. sojeva coccodes izoliranih iz gomolja krumpira u različitim regijama Rusije.
Na temelju dobivenih rezultata i analize sličnih slijedova drugih vrsta dostupnih u bazi podataka GenBank, dizajnirani su početnici specifični za vrstu i sonda za C. coccodes. Da bi se ispitala specifičnost stvorenog testnog sustava, provedena je PCR s DNA izoliranom iz čistih kultura 15 različitih vrsta parazitskih i saprotrofnih gljiva povezanih s biljkama rajčice i krumpira (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Prisutnost DNA Colletotrichum coccodes utvrđena je na pragu ciklusa od 20–27, dok su druge vrste otkrivene nakon 40 ciklusa ili nisu otkrivene. Testni sustav omogućuje pouzdano otkrivanje koncentracije DNA C. coccodes veće od 0.01 ng / mm3 u analiziranoj PCR smjesi. Korištenjem razvijenog sustava za ispitivanje istražena je prisutnost C. coccodes u lišću rajčice sa simptomima gljivičnih bolesti i u gomoljima krumpira bez vanjskih simptoma bolesti. Lišće s simptomima gljivične infekcije sakupljano je s dva različita polja u Krasnodarskom kraju, gomolji - s polja u regijama Kostroma, Moskva, Kaluga i Nižnjeg Novgoroda. Jedan list rajčice koji sadrži DNK C. coccodes pronađen je u Krasnodarskom kraju; značajna prisutnost DNA ovog patogena otkrivena je u 5 uzoraka gomolja uzgajanih u regijama Kostroma, Moskva i Kaluga.
Uvod
Gljive iz roda Colletotrichum opasni su fitopatogeni koji utječu na žitarice, povrće, začinsko bilje, višegodišnje voće i jagodičasto bilje. Jedna od sveprisutnih vrsta ovog roda, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, uzročnik je antraknoze i crne pjegavosti krumpira i rajčice, te uzrokuje bolesti brojnih drugih biljaka iz porodice Solanaceae, uklj. korov (Dillard, 1992.). C. coccodes utječe na sve podzemne dijelove biljke, baze stabljika, lišće i plodove (Andrivon i sur., 1998; Johnson, 1994). Na kori zaraženih gomolja krumpira uočava se razvoj sivih mrlja s nejasno izraženim rubovima na kojima su jasno vidljive crne točkice sporulacije i mikrosklerotije. Tijekom skladištenja u pulpi gomolja mogu nastati čirevi s omekšanim sadržajem, t.j. bolest ulazi u fazu antrakoze, koja je, međutim, izuzetno rijetka.
Istodobno, simptomi antrakoze (čir na koži s malim crnim točkicama) tipični su za plodove rajčice. Na lišću se simptomi C. coccodes pojavljuju kao tamno smeđe mrlje, obično obrubljene žutim tkivom (Johnson, 1994).
Razvoj crne pjegavosti na gomoljima pokvari njihov izgled, što je posebno izraženo kod prodaje opranih crvenokožih krumpira. Piling ljuštenja dovodi do prekomjernog isparavanja i povećanih gubitaka u skladištu (Hunger, McIntyre, 1979). Oštećenje drugih biljnih organa dovodi do gubitka prinosa, što je zabilježeno i na otvorenom i na zatvorenom terenu (Johnson, 1994; Tsror i sur., 1999). Bolesti uzrokovane C. coccodes česte su u gotovo svim regijama svijeta u kojima se proizvodi krumpir, uključujući Rusiju (Leesa, Hilton, 2003; Belov i sur, 2018). Suzbijanje ovih bolesti otežano je zbog nedovoljne učinkovitosti postojećih fungicida protiv C. coccodes i nedostatka otpornih sorti (Read, Hide, 1995).
Inokulum C. coccodes može se zadržati u sjemenskim gomoljima (Read, Hide, 1988 .; Johnson i sur., 1997.), sjemenkama rajčice (Ben-Daniel i sur., 2010.), dugo mogu preživjeti u tlu, na biljnim ostacima (Dillard, 1990. ; Dillard, Cobb, 1993) i u korovu (Raid, Pennypacker, 1987). Brojni autori (Read, Hide, 1988 .; Barkdoll, Davis, 1992.; Johnson i sur., 1997 .; Dillard, Cobb, 1993.) pokazali su da razvoj bolesti u krumpiru i rajčici u velikoj mjeri ovisi o prisutnosti inokuluma u sjemenu i tlo. Stoga je potrebno minimalizirati gubitke od bolesti, dijagnosticirati (uključujući kvantitativne) razmnožavanje gljive u sjemenskom materijalu, u tlu, u gomoljima sjemenskog krumpira i sjemenkama rajčice položenih na skladištenje. Morfološka dijagnostika u tlu i biljnom materijalu može se provesti samo prisutnošću mikrosklerocija, koje se, međutim, mogu naći i kod drugih vrsta gljivica.
Simptomi na gomoljima vrlo su slični srebrnoj krasti koju uzrokuje gljiva Helminthosporium solani. Izolacija Colletotrichum coccodes i Helminthosporium solani u čistu kulturu prilično je teška i traje dugo zbog sporog rasta na hranjivom mediju. Za brzu identifikaciju Colletotrichum coccodes potrebno je koristiti instrumentalne dijagnostičke metode. Najprikladnija metoda je lančana reakcija polimeraze (PCR) i njezina modifikacija - PCR u stvarnom vremenu. Trenutno se u Europi i Sjedinjenim Državama koristi testni sustav koji su razvili britanski istraživači (Cullen i sur., 2002.) za područje rDNA ITS1. Njegova je upotreba pokazala dobre rezultate u analizi ruskih izolata (Belov i sur., 2018.). Međutim, C. coccodes vrlo je varijabilan i njegovo otkrivanje iz jedne sekvence DNA može dovesti do lažno negativnih rezultata. Za pouzdaniju dijagnozu potrebno je analizirati nekoliko vrsta specifičnih sekvenci DNA, u vezi s čim smo razvili izvorni testni sustav koji omogućuje identificiranje C. coccodes prema slijedu gena gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze.
Materijali i metode
Za procjenu učinkovitosti i specifičnosti stvorenih testnih sustava koristili smo čiste kulture 15 vrsta gljiva koje su autori izolirali iz bolesnih uzoraka lišća i plodova rajčice, gomolja krumpira (tablica 1). Za izolaciju uzeli smo organe biljaka sa simptomima gljivične infekcije, ne više od jednog organa po grmu.
Kriška gomolja s korom, kriška ploda rajčice i zahvaćeni list stavljeni su pod binokularni mikroskop, nakon čega su micelij, spore ili komadić tkiva premješteni na agarski medij (agar za sladovine) u Petrijevoj zdjelici s izoštrenom iglom za seciranje. Izolati su pohranjeni na kosim agarima u epruvetama na 4 ° C.
Uzorci lišća rajčice sa simptomima gljivičnih bolesti namijenjeni analizi neposredno nakon sakupljanja (na terenu) stavljeni su u 70% etilni alkohol u kojem su pohranjeni do izolacije DNA. Gomolji krumpira isporučeni su u laboratorij, oguljeni (komad 2 × 1 cm) od njih i smrznuti na –20 ° S. Skladišteno zamrznuto do izolacije DNA.
Čiste kulture gljiva za izolaciju DNA uzgajane su u tekućem mediju graška. Micelij gljive uklonjen je iz tekućeg medija, osušen na filter papiru, smrznut u tekućem dušiku, homogeniziran, inkubiran u CTAB puferu, pročišćen kloroformom, precipitiran smjesom izopropanola i 0.5 M kalijevog acetata i ispran dva puta sa 2% alkohola. Rezultirajuća DNA otopljena je u deioniziranoj vodi i pohranjena na –70 ° C (Kutuzova i sur., 20.). Koncentracija DNA izmjerena je pomoću HS kvantifikacijskog pribora za dvolančanu DNA na Qubit 2017 (Qiagen, Njemačka). Alkoholizirani i smrznuti uzorci su triturirani u tekućem dušiku, zatim je izvršena ekstrakcija DNA kako je gore opisano (za micelij čistih gljivičnih kultura).
Tablica 1. Porijeklo korištenih sojeva gljiva
Ime gljive | Biljka, organ | Mjesto izbora |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | gomolj krumpira | Regija Kostroma, gomolji krumpira 1. poljske generacije, sorta Red Scarlett |
Colletotrichum coccodes 4 | list krumpira | Rep. Mari El, Joškar-Ola |
Helminthosporium solani | gomolj krumpira | Magadanska regija, poz. Šator, gomolj krumpira |
Cladosporium fulvum | list rajčice | Moskovska regija, krupnoplodna rajčica |
Alternaria tomatophila | voće rajčice | podnijelo osoblje laboratorija za mikologiju i fitopatologiju Sveruskog istraživačkog instituta za zaštitu bilja |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | voće rajčice | Krasnodarski teritorij, okrug Krymsky, krema |
Fusarium oxysporum | korijen pšenice | Moskovska regija |
PCR je izveden na DTprime pojačivaču (DNA-Technology). Za PCR korišteni su originalni početnici i sonda za specifičnu regiju glicerol-trifosfat-dehidrogenaznog gena: prednji primer Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, reverzni primer Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1. Primeri pojačavaju područje od 213 bp.
Reakcija je uzela 50 ng ukupne DNA (u analizi lišća i gomolja) i 10 ng (u analizi DNA čistih kultura gljiva). Reakcijska smjesa (35 μl) odvojena je parafinskim slojem na dva dijela: donji (20 μl) sadržavao je 2 μl 10 x reakcijskog pufera (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 mM svakog deoksinukleotid trifosfata, 7 pmol svakog primerka i 4 pmol fluorescentne sonde koja se može hidrolizirati; gornja je sadržavala 1 μl 10 × PCR pufera i 1 U Taq polimeraze.
Odvajanjem smjese s parafinom omogućuje se dugo čuvanje epruveta na temperaturi od 5 ° C i omogućavanje vrućeg početka PCR-u nakon zagrijavanja tijekom 10 minuta na temperaturi iznad 80 ° C. PCR je izveden prema slijedećem programu: 94.0 ° C - 90 s (1 ciklus); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 ciklusa); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 ciklusa); 10.0 ° C - skladištenje.
Rezultati i rasprava
Genske sekvence glicerol trifosfat dehidrogenaze određene su u 45 sojeva izoliranih iz lišća, stabljika, gomolja krumpira i plodova rajčice (Kutuzova, 2018) u različitim regijama Rusije. Ispitivane sekvence svih sojeva podijeljene su u 2 skupine koje se razlikuju u dva nukleotida. Nukleotidne sekvence predstavnika obje skupine pod brojevima KY496634 i KY496635 deponirane su u GenBank.
Primeri coc70gdf, coc280gdr i sonda cocgdz projektirani na njihovoj osnovi provjereni su pomoću programa BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) na svim sekvencama gena glicerol trifosfat dehidrogenaze vrsta iz roda Colletotrichum i drugim organizmima dostupnim u bazi podataka GenBank.
Nisu pronađene DNA regije drugih organizama koji bi bili vrlo homologni početnicima i sondi.
Osjetljivost testnog sustava provjerena je pomoću uzoraka s različitim koncentracijama DNA C. coccodes, DNA lista krumpira zaraženog antraknozom (prikupljeno 2017. u Mari El, sorta Red Scarlett) i kore gomolja zahvaćenih crnom pjegavošću (prikupljenih u regiji Kostroma, sorta Red Scarlett, tablica 2). Da bi se potvrdila prisutnost DNA u gomoljima i lišću krumpira, iz njih su izolirani sojevi C. coccodes u čiste kulture.
Rezultati analize osjetljivosti testnog sustava pokazuju da se on može koristiti za uspješno dijagnosticiranje prisutnosti C. coccodes DNA u uzorku kada je njegov ukupni sadržaj u PCR smjesi veći od 0.05 ng. To je sasvim dovoljno za otkrivanje, jer jedna sklerocija sadrži u prosjeku 0.131 ng, a jedna spora oko 0.04 ng DNA (Cullen i sur., 2002). Test sustav koji je razvila engleska skupina (Cullen i sur., 2002.) pokazao je sličnu osjetljivost (prag ciklusa 34 na 0.05 ng DNA i 37 na 0.005 ng).
Analiza prirodnih uzoraka koji sadrže C. coccodes u svim je slučajevima omogućila pouzdanu otkrivanje njegove prisutnosti u uzorku (tablica 2). Predložena metoda za izolaciju DNA također je bila primjenjiva na analizu prirodnih biljnih uzoraka.
Tablica 2. Određivanje osjetljivosti predloženog testnog sustava za identifikaciju Colletotrichum kokoda za PCR u stvarnom vremenu
Образец | Količina DNA u uzorku *, ng | Ciklus praga | C. otkrivanje kokodova |
---|---|---|---|
Mycelium Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Kora gomolja 1 | 50 | 32 | + |
Kora gomolja 2 | 50 | 30 | + |
Kora gomolja 3 | 50 | 31.5 | + |
List krumpira | 50 | 29.5 | + |
Bilješka. * U mješavini PCR proizvoda.
Specifičnost testnog sustava ispitana je na uzorcima DNA izvađenim iz 15 vrsta gljiva. Autori su izolirali sve sojeve gljiva iz zahvaćenih i zdravih plodova i lišća gomolja rajčice, krumpira; iz korijena pšenice izoliran je jedan soj (tablica 1). Među onima izoliranim s površine ploda postoje vrste koje nisu patogene za rajčicu (na primjer, Phellinus ferrugineovelutinus).
Studije su pokazale da je DNA C. coccodes otkrivena u graničnom ciklusu od 20–27, dok ostale vrste gljiva nisu otkrivene ili su dale signal nakon ciklusa 40, što se može pripisati nespecifičnom učinku buke (tablica 3).
Tablica 3. Provjera sustava za ispitivanje različitih vrsta gljiva
Ime gljive | Ciklus praga |
Colletotrichum coccodes 1 | 20.9 |
C. kokodovi 2 | 22.6 |
C. kokodovi 3 | 23 |
C. kokodovi 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatofila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Bilješka. * Količina DNA u svim uzorcima bila je 10 ng.
Razvijeni testni sustav upotrijebljen je za identifikaciju C. coccodes u uzorcima lista rajčice sa simptomima nekrotrofnih patogena i gomoljima sjemenskog krumpira bez vidljivih simptoma. Za istraživanje smo uzeli sjemenske gomolje različitih sorti uzgajanih u regijama Kostroma, Moskva, Kaluga i Nižnji Novgorod. Prisutnost DNA C. coccodes smatrana je značajnom u uzorcima, u čijoj analizi prag ciklusa nije prelazio 35. Ova prag vrijednost odabrana je na temelju pouzdanog određivanja 0.05 ng DNA C. coccodes DNA (prag ciklusa 33.5, tablica 2) i činjenice da prag ciklusa iznad 40, dijagnosticirana je nespecifična DNA nekih drugih vrsta gljiva. Ovim pristupom otkrivena je značajna prisutnost DNA C. coccodes u 5 uzoraka gomolja uzgajanih u regijama Kostroma, Moskva, Kaluga i u jednom listu rajčice iz okruga Yeisk u Krasnodarskoj regiji (tablice 4, 5).
Tablica 4. Otkrivanje kokota Colletotrichum na gomoljima krumpira *
Broj uzorka | Vrstu krumpira | Mjesto rasta | C. otkrivanje kokodova | Ciklus praga |
---|---|---|---|---|
1 | Crvena Scarlet | Kostromska regija | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Moskovska regija | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky rano | Moskovska regija | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | maza | Kaluga regija. | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | fantazija | Kaluga regija. | - | |
15 | gala | Nizhny Novgorod regija. | - | |
16 | - |
Bilješka. * Količina DNA u svim uzorcima bila je 50 ng.
Tablica 5. Otkrivanje kokota Colletotrichum na lišću rajčice *
Broj uzorka | Mjesto rasta | C. otkrivanje kokodova | Ciklus praga |
---|---|---|---|
1 | Krasnodarski kraj, Krimski okrug | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Krasnodarska oblast, okrug Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Količina DNA u svim uzorcima bila je 50 ng.
Test sustav koji smo stvorili nije inferioran onom koji su razvili britanski istraživači (Cullen i sur., 2002.) u osjetljivosti i specifičnosti te je pogodan za analizu biljnih uzoraka. Njegova primjena za analizu sjemenskih gomolja omogućila je identifikaciju DNA C. coccodes u gomoljima bez vanjskih znakova oštećenja i uspješnu analizu zaraze lišća.
Do danas u Rusiji nije provedena analiza gomolja krumpira na zarazu C. coccodes. Naše prvo istraživanje pokazalo je da od 16 testiranih sjemenskih gomolja uzgajanih u različitim regijama Ruske Federacije, 5 sadrži C. coccodes. To pokazuje da je crna pjegavost gomolja krumpira česta bolest krumpira u Rusiji i podcijenjena je njezina uloga u smanjenju volumena i kvalitete usjeva krumpira.
Analiza lišća rajčice otkrila je značajnu prisutnost DNA C. coccodes u jednom listu iz okruga Yeisk na Krasnodarskom teritoriju. Ranije su prilikom ispitivanja polja rajčice na jugu Rusije pomoću britanskog testnog sustava (Cullen i sur., 2002.) pronađeni listovi koji sadrže C. coccodes, a na nekim poljima pronađen je visok udio lišća zaraženih C. coccodes (Belov i sur., 2018.). U Krasnodarskom i Primorskom teritoriju, Moskovskoj regiji, pronašli smo plodove rajčice, od kojih smo uspjeli izolirati čiste kulture C. coccodes. Moguće je da je C. coccodes mnogo rašireniji na rajčici u Rusiji nego što se sada vjeruje, a podcjenjuje se i njegova štetnost.
Tako je do danas prikupljeno dovoljno podataka o širokoj rasprostranjenosti C. coccodes na krumpiru i rajčici.
Da bismo bolje razumjeli ulogu ove gljive u razvoju bolesti krumpira i rajčice, potrebno je pratiti njezinu rasprostranjenost u Rusiji, proučiti ulogu infekcija tla i sjemena te ulogu crne pjegavosti u gubicima tijekom skladištenja. Korištenje PCR dijagnostike može značajno olakšati ovaj rad, a istodobna uporaba oba testna sustava značajno će povećati točnost analize.
Ovaj je rad podržan grantom Ruske zaklade za znanost br. 18-76-00009.
Članak je objavljen u časopisu "Mycology and Phytopathology" (svezak 54, br. 1, 2020).